農桿菌介導的指狀青霉轉化體系的建立.pdf

1、我國當前作為全世界生產柑橘的第一大國，在柑橘的采后貯藏、運輸過程中，常發(fā)生各種病原微生物引發(fā)的多種病害，導致柑橘的腐爛，并對柑橘產業(yè)造成巨大的損失，其中柑橘綠霉病是最為主要的真菌病害之一。指狀青霉(Penicilliumdigitatum)是柑橘采后主要病害綠霉病的病原菌。其在柑橘采收后從果實傷口處入侵，并以較快速度侵染果實，引起柑橘腐爛。
　　為了有效控制該病害，可通過農桿菌介導的遺傳轉化技術，探明指狀青霉菌的致病機制，從而更好

2、地防治柑橘綠霉病。本研究探索了農桿菌介導的指狀青霉轉化的各項條件，并對部分轉化子進行了分子分析。結果如下:
　　初步建立了農桿菌介導的指狀青霉轉化體系。結果表明:農桿菌介導的轉化體系中最適宜指狀青霉?jié)舛葹?×106個/ml，農桿菌濃度為OD600=0.15-0.25，共培養(yǎng)時長為48h，進行篩選的是40μg/ml的潮霉素B。
　　具體過程是:將濃度是1×106個/ml的指狀青霉菌孢子懸浮液，及預培養(yǎng)過程中添加了200μmol

3、/l乙酰丁香酮后得到的OD600=0.15-0.25的含質粒pTFCM的根癌農桿菌AGL-1菌液，等體積混合后在貼有玻璃紙的CO-IM培養(yǎng)基(含200μmol/lAS)上于24℃避光誘導培養(yǎng)48h，將玻璃紙轉移至滅菌的培養(yǎng)皿上，在玻璃紙上覆蓋含有40μg/ml潮霉素B和200μg/ml頭孢噻肟鈉的篩選培養(yǎng)基。24℃培養(yǎng)4-5d后，將PDA培養(yǎng)基上長出的待定指狀青霉轉化子菌落挑至含40μg/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進行再次篩選。能生長

4、者再將其轉接于PDA培養(yǎng)基上，傳代5次，一次5天后將其接種于含有40μg/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)4天后，能長出菌落的即證明獲得的轉化子能穩(wěn)定遺傳。
　　對轉化子進行了分子分析。提取指狀青霉野生菌及其轉化子的基因組DNA，用引物hph1和hph2對6株轉化子基因組DNA中的T-DNA插入片段潮霉素B基因hph進行PCR擴增。結果證明轉化子中均含有插入的潮霉素片段。本研究利用Tail-PCR方法初步擴增了轉化子插入的