蠟梅脫腺苷酸酶基因CpCAF1的克隆及功能分析.pdf

1、蠟梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]為蠟梅科蠟梅屬的落葉喬灌木植物，是我國特產(chǎn)的傳統(tǒng)名花，具有較高的經(jīng)濟價值和觀賞價值。CAF1是一種脫腺苷酸酶，在mRNA降解中起著重要作用，脫腺苷酸化作用是大多數(shù)真核細胞mRNA降解的第一步。mRNA降解可以對過時的mRNA進行及時清除，同時對發(fā)生突變有害的mRNA進行降解，能夠保證細胞正常的生命活動，也可以引起基因表達變化、改變生物學性狀，作為基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵步驟

2、之一，對生物轉(zhuǎn)錄組重建起重要作用。目前僅有擬南芥、辣椒和水稻CAF1基因功能的研究報導，其結(jié)果表明該基因在植物的生長發(fā)育及生物和非生物脅迫的應答過程中發(fā)揮重要作用。
　　1.CpCAF1基因的結(jié)構(gòu)特征和編碼蛋白特征
　　在以構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫基礎(chǔ)上，通過隨機測序的方法獲得CpCAF1基因的cDNA序列。DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，獲得的cDNA序列包含一個807bp的完整開放閱讀框（Open Reading Frame

3、，ORF）；ProtParam軟件在線預測結(jié)果表明：蠟梅CpCAF1基因編碼269個氨基酸，預測分子式為C1371H2087N349O410S11；分子量為30.37KD，等電點pI是4.70；不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為25.90，是一個穩(wěn)定蛋白；SignalP在線軟件預測顯示，CpCAF1蛋白不具信號肽序列；PSORT軟件進行亞細胞定位預測，表明該蛋白定位在細胞核內(nèi)。
　　利用DNAstar軟件5.0軟件

4、進行多重序列比對，結(jié)果顯示蠟梅CpCAF1基因編碼蛋白與其他物種CAF1基因編碼蛋白的相似性較高，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、梅(Prunus mume)、葡萄（Vitis viifera）、可可（Theobroma cacao）、油棕（Elaeis guineensis）、荷花（Nelumbo nucifera）、蓖麻（Ricinus communis），相似度高達98％，結(jié)構(gòu)比較保守。CpCAF1蛋白屬于D

5、EDD核酸酶家族的DEDDh亞族，其活性區(qū)由3個天門冬甘酸（D）、1個谷氨酸（E）以及鄰近的組氨酸（h）組成。
　　2.CpCAF1基因在蠟梅中的表達特征分析
　　利用實時熒光定量PCR對CpCAF1基因在不同組織、不同開花時期以及不同激素處理蠟梅切花進行表達特征分析。結(jié)果表明，CpCAF1基因在根、莖、葉、花各種組織中均有不同程度表達，其中在老葉中表達量最高，在根中表達量最低；在不同開花階段，CpCAF1基因在各個時期都有

6、所表達，在衰敗期表達量最高，在花蕾期表達量最低；不同激素處理蠟梅切花，SA激素誘導CpCAF1基因的表達，在12h時達到最高；ABA和GA3處理都不同程度的抑制CpCAF1基因的表達，推測CpCAF1基因參與SA、ABA和GA3信號傳導途徑。
　　3.CpCAF1基因轉(zhuǎn)擬南芥的遺傳研究
　　將構(gòu)建好的植物表達載體pCAMBIA2301G-CpCAF1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿EHA105中，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過Kan抗性篩選、GUS

7、染色、DNA鑒定，最終獲得了7個T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。利用實時熒光定量PCR對CpCAF1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達情況進行檢測，選擇高表達株系CpCAF1-5、低表達株系CpCAF1-3進行表型觀察和相關(guān)實驗處理。
　　轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型植株表型觀察結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的抽薹時間、蓮座葉側(cè)枝、和莖生葉側(cè)枝形成時間、第一個花序、第一朵花和第一個果莢出現(xiàn)時間都早于野生型植株。轉(zhuǎn)基因株系的根生長、側(cè)枝生長、蓮座葉生長和果