27932.日本三角渦蟲(chóng)熱休克蛋白70的基因克隆與表達(dá)分析

1、●CLONINGANDEXPRESSIoNANALYSISOFHSP70GENEFRoMFRESHⅥ，ATERPLANARIANDUGESIAJAPONICAADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLouHa0Sup

2、ervisor：ProfChenGuangwenMay，2010^，■嚷爹摘要熱休克蛋白70(HeatShockProtein70，HSP70)是熱休克蛋白家族中的重要成員。大量研究證實(shí)：HSP70在蛋白質(zhì)的折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、錯(cuò)誤折疊蛋白的降解等方面有重要作用，并與細(xì)胞的增殖、分化和神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)建密切相關(guān)，而且其表達(dá)受環(huán)境脅迫和生理脅迫的影響。作為機(jī)體重要的保護(hù)性蛋白，HSP70在渦蟲(chóng)中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用RACE技術(shù)首次在日本三角渦蟲(chóng)

3、中克隆出hsp70(Djhsp70)全長(zhǎng)eDNA序列，并在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)EU380241。以基因組DNA和eDNA為模板擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框(ORF)，測(cè)序結(jié)果相同，說(shuō)明DjhspTO無(wú)內(nèi)含子。Djhsp70cDNA全長(zhǎng)2066bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)1947bp，編碼氨基酸648個(gè)，分子量7118kDa。BLAST檢索分析發(fā)現(xiàn)Djhsp70核苷酸序列與目前已知HSP70家族成員高度同源，氨基酸序列含有真核生物HSP70家族蛋白

4、的三個(gè)標(biāo)簽序列(IDLGTTYS、DLGGGTFD、IvLvGG)以及末端的高度保守序列EEVD。這符合報(bào)道的HSP70的特征。根據(jù)已報(bào)道的HSP70的氨基酸序列，構(gòu)建HSP70親緣關(guān)系樹(shù)，結(jié)果顯示渦蟲(chóng)與軟體動(dòng)物門的貽貝最近，靠近脊椎動(dòng)物，而與線蟲(chóng)和果蠅相距較遠(yuǎn)。上述結(jié)果與渦蟲(chóng)新的分類地位——冠輪動(dòng)物是一致的。我們采用半定量RTPCR技術(shù)研究逆境脅迫對(duì)Djhsp70表達(dá)的影響。結(jié)果表明：以喂食后一周，18℃培養(yǎng)的渦蟲(chóng)為正常對(duì)照。熱處理?xiàng)l

5、件下，lO℃時(shí)表達(dá)量較對(duì)照組稍有增加，當(dāng)溫度升高至30℃并持續(xù)24h，其表達(dá)量明顯升高，較對(duì)照組差異顯著(P005)；32℃持續(xù)48h，表達(dá)量達(dá)對(duì)照組的近兩倍。饑餓處理?xiàng)l件下，饑餓15d時(shí)表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)明顯變化，饑餓30d后，表達(dá)量顯著升高，60d后喂食，表達(dá)量迅速降低。切割處理?xiàng)l件下，切割12h時(shí)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P005)，36h時(shí)表達(dá)量最大，48h時(shí)有所降低。由此我們認(rèn)為，Djhsp70是誘導(dǎo)型hspZO基因，與渦蟲(chóng)的熱耐

6、性，抗饑餓以及組織損傷修復(fù)密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究DjHSP70在組織學(xué)上的定位，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Djhsp70C端多肽原核表達(dá)載體，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出約21kDa的融合蛋白。采用NiAgarose樹(shù)脂對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，電泳顯示純化的融合蛋白純度很高，經(jīng)狄度掃描分析純度達(dá)到95％以上。以純化的融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，成功制備兔抗HSP70多克隆抗血清。Westernblotting檢測(cè)顯示該抗血清能與渦蟲(chóng)HSP70特異性結(jié)合，與