鵝MHC classⅠcDNA克隆、基因組結(jié)構(gòu)、等位基因多態(tài)性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)指集中于某一染色體、編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的一類(lèi)細(xì)胞膜糖蛋白基因群.其功能不僅限于移植排斥反應(yīng),它還與機(jī)體對(duì)外源性抗原的免疫應(yīng)答之間存在關(guān)聯(lián).這種發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)MHC研究的濃厚興趣.從DDBJ/EMBL/GenBank基因庫(kù)中讀取雞、其它鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)和哺乳類(lèi)的MHC Ⅰ類(lèi)基因,進(jìn)行序列分析,在MHC class Ⅰα<,2>鏈兩個(gè)半

2、胱氨酸保守區(qū)域的外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物;使用Trizol試劑盒,提取鵝脾臟總RNA,用RT-PCR方法從鵝的脾臟fcDNA中克隆MHC Ⅰα<,2>鏈部分基因并測(cè)序,根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)一上游引物,使用3'-RACE PCR方法克隆MHCⅠα<,2>到3'一端PolyA序列;再根據(jù)所克隆的MHCⅠα<,2>鏈測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一下游引物,使用eDNA雙鏈合成試劑盒和PCR Library kit試劑盒克隆5'-UT到MHCⅠα<,2>部分序列,

3、然后,將5'和3'一端兩段測(cè)序結(jié)果拼接起來(lái),重新設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物,克隆MHCⅠ的全基因序列.在獲得全基因序列的基礎(chǔ)上,用LA-PCR方法從鵝基因組DNA中克隆了MHC Ⅰ類(lèi)分子的基因組序列并分析其基因組結(jié)構(gòu).及從另外4羽不同個(gè)體鵝的脾臟組織得到fcDNA,使用RT-PCR方法克隆MHCⅠ等位基因全序列,運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行其多態(tài)性分析.最后使用RT-PCR方法檢測(cè)了MHCⅠ在鵝不同組織器官中的表達(dá)水平.通過(guò)對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)、

4、等位基因多態(tài)性、多肽結(jié)合區(qū)(PBD)的氨基酸置換率和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化分析.結(jié)果顯示Ancy-MHCⅠ成熟蛋白全長(zhǎng)348個(gè)氨基酸,在α<,1>和α<,2>區(qū)有14個(gè)高置換位點(diǎn).基因組DNA由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成.根據(jù)其遺傳距離可將5個(gè)個(gè)體的Ancy-MHCⅠ分為3個(gè)類(lèi)型(-UA~-UC).Ancy-MHCⅠ氨基酸序列中保留了HLA-A2與抗原多肽結(jié)合的7個(gè)關(guān)鍵性氨基酸.不同等位基因序列同源率為85.1~98.9﹪,鵝與雞的序列同源率