豬傳染性胸膜肺炎免疫熒光和PCR診斷方法研究及apxⅣA的克隆與序列分析.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌.該研究將用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的外膜脂蛋白純化后免疫新西蘭白兔,收集高免血清作為一抗,用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的羊抗兔IgG作為二抗,建立了間接熒光抗體試驗(Indirect fl

2、uorescent assay,IFA).同時從高免血清中提純IgG再標記FITC,作為熒光抗體,建立了直接熒光抗體試驗(Direct fluorescent assay,FA).這兩種試驗分別對血清1-13型APP標準株均出現(xiàn)熒光信號,而血清15型APP標準株、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鏈球菌等其它相關細菌不出現(xiàn)陽性反應.IFA和FA對APP的最小檢出濃度分別為10<'4>CFU

3、/ml和10<'5>CFU/ml.多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)由于具有敏感快速的優(yōu)點,已被成功應用于許多病原的快速檢測和疾病診斷中.該研究中設計合成了一對引物,以毒素Ⅳ基因(apxⅣ)為擴增的目的基因,利用胸膜肺炎放線桿菌血清1型標準菌株為模板,經過模板制備方法和反應條件的篩選,建立了胸膜肺炎放線桿菌的PCR檢測方法.該方法能從胸膜肺炎放線桿菌13個血清型(1-13型)中擴增出預期的apxⅣ

4、基因中大小為422bp的片段;胸膜肺炎放線桿菌血清型15型、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和鏈球菌擴增結果為陰性.對APP的最低檢出濃度是1.29×10<'2>CFU/ml.重復性試驗說明,該方法重現(xiàn)性好.對人工感染動物和139份臨床送檢病料進行檢測,并與細菌學檢測結果進行比較.實驗感染動物樣品細菌分離為陽性,同時用上述3種方法檢測也為陽性,有較好的一致性;臨床可疑病料中,有36(25.

5、90﹪)株為IFA陽性,29(20.86﹪)株為FA陽性,42(30.22﹪)株為PCR陽性,從7份病料中分離到該病原.這些初步研究結果表明,所建立的熒光抗體試驗和PCR診斷方法可以應用于胸膜肺炎放線桿菌感染的檢測,在檢出率方面優(yōu)于細菌分離鑒定方法.ApxⅣ基因是新報道的毒力相關基因,僅在感染動物體內表達,具有潛在診斷意義.而且,其與該病原毒力的相關性尚未闡明.該研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列,設計了一對引物,通過PCR擴增,獲得了