13934.嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定

1、分類號Q812學校代碼10129UDC57.08學號2010211011嗜熱菌β糖苷酶基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定StudyonConstructionTransfectionofMammaryGlSpecificExpressionVectfSsβgly申請人：杜威學科門類：理學學科專業(yè)：發(fā)育生物學研究方向：動物遺傳與發(fā)育指導教師：周歡敏教授論文提交日期：二〇一三年六月摘要利用牛乳腺生物反應器產(chǎn)生乳糖分解酶從而生產(chǎn)低乳糖牛

2、奶，是解決乳糖不耐癥的一種手段，而構(gòu)建高效、特異的表達載體是制備乳腺生物反應器的關(guān)鍵步驟。本實驗將來源于古細菌的嗜熱菌β糖苷酶基因（LacS）根據(jù)牛的密碼子使用頻率進行了密碼子優(yōu)化，并合成了優(yōu)化后的基因。以牛乳球蛋白（BLG）上游調(diào)控區(qū)域做為啟動子，以嗜熱菌β糖苷酶（LacS）為目的基因，添加了Loxp錨定的新霉素抗性基因（Neo）和增強型綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)，構(gòu)建了pLOXEGFPBLGLacS載體。并且通過脂質(zhì)體介導方法

3、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠的乳腺癌細胞，并篩選得到單克隆。陽性單克隆通過PCR進行DNA水平的整合檢測；經(jīng)催乳素誘導后的陽性單克隆通過RTPCR進行mRNA水平表達檢測。研究結(jié)果如下：首先乳腺特異表達載體的構(gòu)建。通過PCR技術(shù)擴增出924bp牛β乳球蛋白（BLG）基因5調(diào)控序列，并與T載體連接記為pMD19BLG，質(zhì)粒大小為3.7kb。然后將其與公司優(yōu)化合成的pUC57LacS質(zhì)粒，pLOXEGFP質(zhì)粒通過相應的酶切后進行連接，經(jīng)基因重組后構(gòu)建

4、了乳腺特異性表達載體pLOXEGFPBLGLacS。使牛β乳球蛋白基因5端調(diào)控序列啟動嗜熱菌糖苷酶基因在乳腺中特異表達，而新霉素抗性基因和EGFP的表達，便于篩選陽性克隆。其次，乳腺特異性表達載體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細胞。37℃水浴解凍小鼠乳腺癌細胞，并進行G418最小致死濃度測定然后通過脂質(zhì)體介導重構(gòu)載體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細胞，并通過PCR和RTPCR的方法進行重構(gòu)載體的整合檢測和表達檢測。結(jié)果表明，小鼠乳腺癌細胞G418最小致死濃度為700μ