乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期事件的探討.pdf

1、背景：乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤。骨骼是乳腺癌常見的遠處轉(zhuǎn)移部位之一，高達70-80％的乳腺癌可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。由于骨轉(zhuǎn)移可以引起病理性骨折和劇烈的骨痛，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，而常規(guī)化、放療和手術又不能延長晚期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生存期，因此，深入研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子和細胞學機制，特別是骨轉(zhuǎn)移早期的分子機制對于早期診斷并綜合各種手段有效控制骨痛和減少骨相關事件的發(fā)生，有著重要的臨床意義。 目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的確切分子機制還不清楚。

2、當前研究認為骨干骺端血管結(jié)構(gòu)與腫瘤細胞的粘附、腫瘤細胞向血管外浸潤與骨基質(zhì)的粘附、腫瘤細胞與骨細胞及骨髓微環(huán)境的交互作用等方面在骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要的作用。但由于缺乏合適的動物模型和骨組織結(jié)構(gòu)的復雜性，使腫瘤特異性骨轉(zhuǎn)移的機制研究受限。 隨著神經(jīng)科學的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)不僅參與支配局部組織的生理活動，它還可以通過與細胞膜表面的特異性受體結(jié)合進行信號傳導，進而對靶細胞分化、生長、代謝、細胞骨

3、架結(jié)構(gòu)、基因表達產(chǎn)生影響。其中，神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)對腫瘤增殖和分化的調(diào)控作用、調(diào)控機理及腫瘤細胞表面神經(jīng)肽受體的表達與腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移的密切關系正日益受到研究者的注意。為此，本課題研究了前速激肽原(preprotachykinin-I，PPT-I)及速激肽受體NK-1和NK-2在乳腺癌中的表達及其在乳腺癌增殖中的作用，并初步探討了它們在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期事件中的可能作用機制，為進一步揭示乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機制，進而為骨轉(zhuǎn)移的預防、早期診斷以及

4、制定合理有效的綜合治療方案提供重要的理論依據(jù)。 第一部分：PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中的表達目的：研究PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌及其癌旁組織以及乳腺癌細胞系T-47D、MCF-7和正常乳腺上皮細胞系HBL-100中的表達，探討PPT-I、NK-1和NK2的表達與乳腺癌的惡性生物學行為之間的關系。 方法：首先通過免疫組化技術檢測了37例乳腺癌及其癌旁組織以及乳腺癌細胞系T-47D、

5、MCF-7和正常乳腺上皮細胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的表達。然后采用實時熒光定量PCR和Westernblot檢測了乳腺癌細胞系T-47D，MCF-7，MDA-MB-435，以及正常乳腺上皮細胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表達。 結(jié)果：乳腺癌組織NK-1、NK-2和PPT-I的陽性表達率分別為83.8％、81.1％和86.5％，而癌旁組織三個指標的表達率分別為18.8％

6、、75％和21.9％，兩者比較乳腺癌組織的NK-1和PPT-I的表達率明顯高于癌旁組織(p＜0.01)，而NK-2的表達兩者差別不大。PPT-I和NK-1在3個乳腺癌細胞系呈高表達，在正常乳腺上皮細胞HBL-100中呈低表達，而NK-2表達在幾個細胞系中沒有明顯差異。 結(jié)論：PPT-I和NK-1的表達可能與乳腺癌的惡性增殖和浸潤能力有關。 第二部分：NK-1和NK-2受體拮抗劑對乳腺癌細胞系T-47D的增殖的影響目的：通

7、過研究NK-1和NK-2受體拮抗劑對于乳腺癌細胞系T-47D增殖的影響，進一步探討速激肽生物網(wǎng)絡在乳腺癌惡性增殖中的重要作用。 方法：將乳腺癌細胞系T-47D分為四個組，即空白對照組、NK-1受體拮抗劑組、NK-2受體拮抗劑組和NK-1、NK2受體拮抗劑聯(lián)合用藥組，分別采用克隆形成實驗和細胞生長周期檢測的方法，觀察用藥后四個組的細胞增殖情況。 結(jié)果：加入NK受體拮抗劑后，乳腺癌細胞的克隆形成被明顯地抑制，但在同時加入兩種

8、拮抗劑的實驗組并沒有完全阻斷其增殖，仍然看到了乳腺癌細胞的生長，這提示我們?nèi)橄侔┘毎赡苓€同時存在其它的途徑促進其生長。同時我們通過流式細胞儀對細胞增殖周期的檢測中發(fā)現(xiàn)，加入拮抗劑后，大量細胞被阻滯在了S期和G0/G1期，而沒有進入G2/M期進行分裂增殖。 結(jié)論：速激肽受體NK-1和NK-2在乳腺癌細胞系T-47D生長中的具有重要作用，提示乳腺癌細胞可能存在速激肽的自分泌和旁分泌作用，通過這些作用可以促進自身的增殖。 第

9、三部分PPT-I、NK-1和NK-2的表達與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移之間相互關系的探討目的：探討PPT-I基因、速激肽受體NK-1和NK-2的表達與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移之間可能存在的相關關系。 方法：將乳腺癌細胞系T-47D與正常成人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)等量混合培養(yǎng)，分別在混合培養(yǎng)后48小時和96小時，采用免疫磁珠陽性分選的方法，從共培養(yǎng)體系中分離出T-47D細胞，分別采用realtime-PCR檢測混合前后T-47D細胞PPT-I、NK-1

10、和NK-2的mRNA表達變化；western-blot檢測混合前后T-47D細胞PPT-I、NK-1和NK-2的蛋白表達的變化；利用透射電鏡觀察混合前后T-47D超微結(jié)構(gòu)的變化；流式細胞儀檢測T-47D增殖周期的變化；以及混合培養(yǎng)后T-47D細胞的生長曲線的變化。 結(jié)果：與骨髓間充質(zhì)干細胞混合培養(yǎng)后T-47D細胞的增殖明顯減慢，細胞周期也發(fā)生了改變，大量細胞被阻滯在了S期，而沒有進入G2/M期進行分裂增殖，類似于一種接觸性抑制的

11、狀態(tài)。電鏡超微結(jié)構(gòu)的觀察也證實了混合培養(yǎng)后T-47D細胞遺傳物質(zhì)合成的增加，但同時卻出現(xiàn)了大量糖原顆粒的堆積，提示我們混合后T-47D細胞的增殖受到明顯抑制。與MSC混合培養(yǎng)96小時后，T-47D細胞的PPT-I的蛋白及mRNA表達明顯發(fā)生了上調(diào)，而NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表達明顯下降。 結(jié)論：乳腺癌細胞在骨轉(zhuǎn)移早期很可能是通過前速激肽原基因PPT-I的表達上調(diào)而獲得在骨髓基質(zhì)中的生存，同時它所表現(xiàn)的接觸性抑制的狀態(tài)很