臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的功能及轉(zhuǎn)基因抗腫瘤的研究.pdf

1、目的：探討人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells hUCMSC)的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性。開展hCMSC慢病毒轉(zhuǎn)基因抗腫瘤的初步研究。 方法：采用組織塊貼壁培養(yǎng)方法獲得hUCMSC，并對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)，應(yīng)用PKH26和二咪基苯基吲哚(DAPI)染色方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期及表面抗原特征FITC-CD34，CD71，HLA-DR，PE-CD29，

2、CD38，CD44，CD105和HLA-I；染色體遺傳分析及繪制生長(zhǎng)曲線；利用地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油、bFGF和地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、消炎痛誘導(dǎo)第3代HuCMSC分別向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，并通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)、Von Kossa和油紅O染色進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)PCR，RT-PCR等方法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。構(gòu)建融合基因TNFα-Tumstatin的慢病毒載體，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和hUC

3、MSC，通過(guò)PCR，RT-PCR，ELISA，H-TdR檢測(cè)融合基因及其蛋白的表達(dá)，觀察抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。 結(jié)果：hUCMSC在培養(yǎng)了兩周后，大多呈纖維狀生長(zhǎng)，細(xì)胞傳至第2代時(shí)，則為均一的長(zhǎng)梭形細(xì)胞。在經(jīng)PKH26和DAPI染色后，可見細(xì)胞有一個(gè)藍(lán)色的平滑的核，胞漿呈紅色，并可維持20天左右。在傳代4個(gè)月后(約26代)，細(xì)胞仍然保持了其生物學(xué)特性。流式分析顯示：CD29，CD44，CD95，CD105，HLA-I表達(dá)陽(yáng)性，CD

4、34，CD38，CD71，HLA-DR不表達(dá)。染色體核型正常。第3代細(xì)胞周期分析顯示：G<,0>G/<.1>，G<,2>/M和S期分別為88.86％，5.69％和5.45％。經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)，ALP、Von Kossa和油紅O染色均呈不同程度的陽(yáng)性，RT-PCR．結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞分別表達(dá)了骨形成蛋白．3(BMP-3)和過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體Y2(PPARγ2)等基因。hUCMSC還表達(dá)了骨髓MSC所表達(dá)的BMI-1和nucleos

5、temin基因。成功構(gòu)建融合基因TNFα-Tumstatin的慢病毒載體，包裝293T細(xì)胞后可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50％以上，在轉(zhuǎn)化293T和hUCMSC后，基因組中可檢測(cè)到融合基因，表明轉(zhuǎn)染成功。慢病毒上清中可以檢測(cè)到融合蛋白的表達(dá)并且對(duì)腫瘤細(xì)胞L1937(人髓系白血病細(xì)胞株)具有抑制作用。 結(jié)論：JUCMSC具有與骨髓。MSC相似的生物學(xué)特性，尤其具有向成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化的多潛能性特點(diǎn)。hUCMSC的慢病毒轉(zhuǎn)基因抗