我國豬鏈球菌2型新毒力因子的研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一種重要的人獸共患病病原菌,能引起人和豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥以及突發(fā)性死亡。中國于1998年和2005年在江蘇和四川局部地區(qū)暴發(fā)了較大規(guī)模的豬及其人感染豬鏈球菌病例,累計報告人感染豬鏈球菌病例達204例,其中死亡38例,不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大威脅,而且嚴重影響公共衛(wèi)生安全。值得注意的是兩度人重癥感染死亡病例多表現(xiàn)為中毒樣休克綜合征。迄今為

2、止,對豬鏈球菌毒力因子的認識非常有限,基本得到確認的毒力因子有莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)等,但由于毒力因子的多樣性和復(fù)雜性,單靠現(xiàn)有毒力因子還不足以解釋導(dǎo)致我國兩度暴發(fā)豬鏈球菌病的原因。因此,分離和鑒定更多的SS2毒力因子已成為該領(lǐng)域的研究熱點。
　　微生物蛋白質(zhì)組學是發(fā)掘新型毒力因子的有效手段。本課題組前期利用免疫蛋白質(zhì)組學對我國流行株的細胞壁蛋白進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國流行

3、株細胞壁上存在著8個不同的抗原,具有很好的免疫保護原性,是潛在的毒力因子。
　　目前已完成測序的豬鏈球菌菌株有歐洲株p1/7和美洲株89/1591。2005年中科院基因組研究所完成了98和05年暴發(fā)流行株98HAH12和05ZYH33的測序工作,并完成了無毒株05HAS68的草圖用作比較研究,結(jié)果顯示在中國流行株中存在一個大小為89kb的可能毒力島PAI,命名為89K。序列比對和實驗證明89K僅在中國流行株中存在。因此,89K毒力

4、島很可能是導(dǎo)致我國豬鏈球菌病暴發(fā)流行的因素之一。對89K進一步功能注釋結(jié)果顯示89K上可能與毒力相關(guān)的基因有:3個控制物質(zhì)運輸?shù)腁BC transporter,2個雙組分系統(tǒng)(TCSTS),3個Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)的組件。
　　本研究主要從兩個方面對中國豬鏈球菌2型毒力因子進行探討,一是表面蛋白上5個基因的分析和鑒定,二是89K毒力島上ABC transporter上3個基因的分析和鑒定。表面蛋白上的5個基因是05SSU_02

5、72、05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664,89K毒力島上的3個基因是05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948。論文分三個部分對這些潛在毒力因子進行闡述。
　　首先是免疫原性蛋白05SSU_0272及毒力的分析。05SSU_0272是新發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌表面蛋白,具有較強的免疫原性,在大鼠抗血清調(diào)理人全血殺菌試驗中的殺菌率在50％以上。對05SSU_0272序列

6、分析發(fā)現(xiàn)其含有LPXTG基序,含有該基序的表面蛋白在許多致病菌中都有發(fā)現(xiàn)。分析蛋白序列發(fā)現(xiàn)該蛋白含有2個高度一致的重復(fù)序列,且該重復(fù)序列在不同菌株中存在多態(tài)性。05SSU_0272在GeneBank上功能注釋為延伸因子,但是突變株Δ0272表達譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),受其影響的基因只有為數(shù)不多的幾個,說明它可能不是延伸因子,而是另具其它功能的蛋白。通過同源重組方法獲得05SSU_0272突變株Δ0272,同時構(gòu)建其互補株CΔ0272。細胞黏附實驗發(fā)

7、現(xiàn),Δ0272對Hep2細胞的黏附能力明顯降低而CΔ0272又重新恢復(fù)了Δ0272的黏附能力,掃描電鏡同時印證了這個結(jié)果;全血殺傷結(jié)果表明,Δ0272在人全血中抵御血液中天然免疫細胞的吞噬和殺菌能力減弱,更容易被宿主清除,而CΔ0272重新恢復(fù)了其在血中的存活能力;CD1小鼠競爭感染實驗說明突變株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠腦膜炎感染實驗中突變株與野生株在72h血中菌數(shù)一致而在72h腦中野生株菌數(shù)為突變株的幾十倍,說明野生株比突

8、變株通過血腦屏障能力強;豬競爭感染實驗中CI值小于0.001,說明突變株較野生株而言更容易被清除。結(jié)果表明該蛋白很可能是豬鏈球菌潛在的毒力因子,但其在豬鏈球菌致病過程中的具體作用還需進一步研究。
　　05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664是通過蛋白質(zhì)組學同時發(fā)現(xiàn)的新型免疫原性蛋白,WB結(jié)果顯示05SSU_1664可能為我國高致病株與普通致病株及國外菌株的差異表達蛋白;05SSU_15

9、38、05SSU_1083重組抗原在6名病人和5名健康人血清中的抗體水平表現(xiàn)出顯著性差異;05SSU_1538、05SSU_1083、05SSU_1664重組抗原的抗體在人工感染小型豬前后血清中的變化情況統(tǒng)計學上差異顯著;05SSU_1083在大鼠抗血清調(diào)理人全血殺菌試驗中的殺菌率達到50％以上。序列分析發(fā)現(xiàn),05SSU_1000、05SSU_1538、05SSU_1664含有LPXTG基序和信號肽序列,05SSU_1083含有信號肽序

10、列,含有這些序列的表面蛋白很可能與毒力相關(guān)。本研究對這4個基因嘗試了敲除工作,獲得了這幾個新型免疫原性蛋白的突變株。細胞黏附實驗發(fā)現(xiàn),Δ1664對Hep2細胞的黏附率10.82％低于野生株05ZYH33的黏附率14.16％且有統(tǒng)計學差異,Δ1083對Hep2細胞的黏附率13.25％低于野生株05ZYH33的黏附率15.47％;全血殺傷結(jié)果表明,野生株05ZYH33在人全血中殺傷率為33.96％,Δ1000為72.95％,Δ1538、Δ1

11、664、Δ1083分別為28.06％、37.60％、27.74％,結(jié)果說明Δ1000在人的全血中抵御血液中天然免疫細胞的吞噬和殺菌能力減弱;CD1小鼠競爭感染實驗中Δ1000、Δ1538、Δ1664、Δ1083與野生株的競爭感染指數(shù)分別為:0.60±0.24、0.61±0.16、0.82±0.29、0.77±0.30,說明這些突變株的增殖受到了野生株的抑制;CD1小鼠腦膜炎感染實驗中Δ1000、Δ1538和Δ1664與野生株05ZYH3

12、3在血中菌數(shù)一致而在腦中野生株菌數(shù)為突變株的幾十倍,說明野生株比突變株通過血腦屏障能力強,Δ1083與野生株05ZYH33在血中和腦中菌數(shù)一致;豬競爭感染實驗,05ZYH33/Δ1664組在12h、24h、36h和48h的CI值分別為1.45、0.30、0.27、0.07,05ZYH33/Δ1083組在12h、24h、36h和48h的CI值分別為0.45、0.32、0.25、0.07,05ZYH33/Δ1000在12h、24h、36h、

13、48h和60h的CI值分別為0.11、0.07、0.37、0.13、0.008,CI值小于0.1,說明這些突變株的增殖受到了野生株的抑制。結(jié)果表明這些免疫原性蛋白可能影響到我國豬鏈球菌2型的毒力,是潛在的毒力因子。
　　ABC轉(zhuǎn)運蛋白可能參與毒素的輸出,與細菌的致病性和多藥耐藥相關(guān)。認為89K毒力島可能是導(dǎo)致中國豬鏈球菌病暴發(fā)流行的因素之一。實驗室前期構(gòu)建了05SSU_0910、05SSU_0946和05SSU_0948這3個基因

14、的插入失活體,在動物實驗中發(fā)現(xiàn)與野生株相比毒力降低,因此,構(gòu)建了敲除突變體來消除失活突變體帶來的極性影響。從溶血活性來看,野生株和突變株并無差異,但生長情況發(fā)現(xiàn),Δ0948的生長速度要明顯慢于野生株和其它突變株。Δ0948的Hep2細胞黏附實驗、CD1小鼠實驗、豬競爭感染實驗結(jié)果說明其可能與毒力相關(guān)。Δ0946豬競爭感染實驗說明其可能與毒力相關(guān)。Δ0910體內(nèi)外實驗說明其可能與毒力無關(guān)。89K毒力島是否真是導(dǎo)致我國豬鏈球菌病暴發(fā)的因素之