托吡酯相關(guān)的小鼠泌汗障礙模型建立和機(jī)制初步研究.pdf

1、托吡酯(topiramate,TPM)是一種新的抗癲癎藥，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為2，3：4，5－雙－O－(1-甲基亞乙基)－β－右旋－氨基磺酸吡喃果糖，在多種癲癎發(fā)作類型治療中有效，包括局灶性癲癎發(fā)作、原發(fā)性強(qiáng)直陣攣發(fā)作、Lennox-Gastaut綜合征等[1-2]。其作用機(jī)制有：1.可阻斷神經(jīng)元持續(xù)去極化導(dǎo)致的反復(fù)電位發(fā)放，此作用與使用TPM后的時(shí)間密切相關(guān)，表明TPM可以阻斷鈉通道[3]；2.可以增加γ-氨基丁酸（GABA）激活GABAA受

2、體的頻率，加強(qiáng)氯離子內(nèi)流，增強(qiáng)抑制性中樞神經(jīng)遞質(zhì)的作用[4，5]；3.降低谷氨酸AMPA受體的活性[6，7]，抑制谷氨酸和天冬氨酸的釋放[8]，降低興奮性中樞神經(jīng)遞質(zhì)的作用；4. 抑制碳酸酐酶，特別是其同工酶CA II和CA IV [9]；5.對(duì)K+通道電流的調(diào)節(jié)作用[10]；6.抑制神經(jīng)元L-型電壓激活鈣離子通道[11]。 最近陸續(xù)報(bào)道TPM在治療兒童癲癎時(shí)出現(xiàn)少汗或無(wú)汗為主要表現(xiàn)的對(duì)熱不耐受現(xiàn)象[12-17]，該現(xiàn)象是可逆

3、的，當(dāng)停用TPM時(shí)，少汗表現(xiàn)消失。泌汗障礙發(fā)生率一般在10％－20％左右，但有研究發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)臨床癥狀者，其發(fā)汗試驗(yàn)提示有出汗量下降，下降人數(shù)超過(guò)測(cè)試總?cè)藬?shù)的50％。這個(gè)現(xiàn)象提示TPM相關(guān)的泌汗障礙存在普遍性。 目前TPM 引起泌汗障礙的機(jī)制尚不清楚。根本的原因是汗液的調(diào)節(jié)機(jī)制尚處于研究中。有研究提示泌汗障礙與TPM 對(duì)碳酸酐酶亞型抑制有關(guān)，該抑制作用減低了汗液原液的分泌，減少汗液的形成從而導(dǎo)致泌汗率下降。但作為一個(gè)酶類，其調(diào)節(jié)存

4、在一個(gè)過(guò)程，機(jī)體并不能快速的調(diào)節(jié)此過(guò)程，因此這種假設(shè)還有待證實(shí)。在小鼠汗腺分泌細(xì)胞的管腔側(cè)和基底側(cè)均存在AQP5 表達(dá)，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白參與了汗液的分泌過(guò)程。但也有研究提出該蛋白與泌汗沒(méi)有聯(lián)系。因此，泌汗障礙的原因有待進(jìn)一步研究。 泌汗通路起始于丘腦下部視前區(qū)，經(jīng)腦干側(cè)索中央下行，到達(dá)脊髓的中間外側(cè)柱，位于中間外側(cè)柱的節(jié)前神經(jīng)元發(fā)出纖維到達(dá)同側(cè)的交感神經(jīng)節(jié)，換元后發(fā)出節(jié)后纖維支配汗腺器官。人類在高溫或運(yùn)動(dòng)時(shí)的熱驅(qū)散主要依靠小汗

5、腺的蒸發(fā)而帶來(lái)的散熱作用。因此，汗液的產(chǎn)生對(duì)熱耐受程度產(chǎn)生重要的影響，出汗可以防止運(yùn)動(dòng)中出現(xiàn)過(guò)熱現(xiàn)象。汗腺由交感節(jié)后神經(jīng)元軸突支配，不同于一般的交感神經(jīng)節(jié)后遞質(zhì)，汗液的分泌以乙酰膽堿為主要神經(jīng)遞質(zhì)。嚙齒類動(dòng)物的汗腺主要位于足墊和足指（趾），小汗腺的出汗可以由擬膽堿劑、腎上腺素等注射或熱刺激運(yùn)動(dòng)刺激激發(fā)。TPM 是如何引起在兒童的泌汗障礙的，是否與對(duì)膽堿能系統(tǒng)的作用有關(guān)系？實(shí)驗(yàn)以此著手展開(kāi)研究。 本研究首先采用硅膠印跡模型觀察了

6、TPM 在小鼠引起的泌汗功能情況。 其次在此模型基礎(chǔ)上應(yīng)用HE 染色法和電鏡下觀察TPM 引起的泌汗障礙是否與汗腺結(jié)構(gòu)變化有關(guān)系；采用免疫組化染色觀察支配汗腺的一般神經(jīng)末梢、膽堿能神經(jīng)、腎上腺能神經(jīng)及膽堿能M3 受體的表達(dá)變化。并結(jié)合蛋白印跡和免疫組織化學(xué)觀察膽堿酯酶在汗腺的表達(dá)，進(jìn)行膽堿酯酶活性測(cè)定。此外對(duì)GABA 神經(jīng)元參與脊髓和丘腦下部區(qū)域的交感活動(dòng)進(jìn)行了形態(tài)上的初步的探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： （1）2 周齡的幼鼠

7、每天經(jīng)灌胃給予TPM（80mg/kg），連續(xù)給藥一個(gè)月后和停藥后一周，對(duì)小鼠進(jìn)行匹羅卡品刺激發(fā)汗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TPM 處理后小鼠與對(duì)照組小鼠相比其分泌汗腺數(shù)目下降17％，單位汗腺的泌汗量下降40％。光鏡結(jié)構(gòu)和汗腺的超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯改變。 （2）與對(duì)照相比，TPM 處理對(duì)汗腺腺周一般神經(jīng)支配PGP9.5、膽堿能神經(jīng)支配標(biāo)志物ChAT、腎上腺能標(biāo)志物TH 神經(jīng)支配面積無(wú)明顯影響；對(duì)膽堿能毒蕈堿M3 受體表達(dá)以及對(duì)星狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)

8、無(wú)明顯影響。單個(gè)汗腺分泌部的面積無(wú)明顯變化。 （3）TPM 處理后汗腺AChE 免疫熒光及蛋白免疫印跡表達(dá)結(jié)果與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，汗腺組織勻漿后提示TPM 對(duì)AChE 活性無(wú)明顯影響。 （4）交感節(jié)前神經(jīng)元存在ChAT 和GAD65 免疫熒光雙標(biāo)記。熱激活后，丘腦下部熱敏感神經(jīng)元與GABA 能神經(jīng)元存在雙標(biāo)記。 從這些結(jié)果中可以初步得出以下結(jié)論： （1）TPM（80mgkg-1d-1）較長(zhǎng)時(shí)期給藥

9、在一定程度上降低了小鼠的泌汗功能，停藥后泌汗功能恢復(fù)。 （2）TPM 導(dǎo)致的泌汗障礙沒(méi)有影響到小鼠汗腺的面積大小和形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)。 （3）長(zhǎng)期的TPM 處理可降低小鼠外泌汗腺對(duì)匹羅卡品的分泌反應(yīng)性，TPM未影響到小鼠汗腺的交感神經(jīng)發(fā)育和支配、汗腺周圍的膽堿能毒蕈堿M3 受體表達(dá)，對(duì)汗腺部位的AChE 表達(dá)及其活性也無(wú)明顯影響。 （4）GABA 能神經(jīng)元可能參與節(jié)前膽堿能神經(jīng)元調(diào)節(jié)、GABA 能神經(jīng)元參與丘腦下