后腎間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠缺血再灌注急性腎小管損傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 腎臟急性腎小管壞死(Acutetubularnecrosis，ATN)是引起腎小管功能損害的常見(jiàn)原因，也是由此而引起。腎功能衰竭的主要原因，其修復(fù)直接關(guān)系到腎臟疾病的病程和預(yù)后。急性缺血性腎損害，是急性腎小管壞死的主要病因，常常發(fā)生于腎動(dòng)脈硬化、腎移植、大量出血而致休克等情況下。腎臟在發(fā)生缺血后，腎小管細(xì)胞隨之發(fā)生壞死凋亡，從基底膜脫落或是分化為間充質(zhì)表型，而分化后的細(xì)胞逐漸伸展并遷移至受損腎小管的基底膜處，并最終在此增

2、殖再生而修復(fù)受損的腎小管，這就是傳統(tǒng)的腎小管自身修復(fù)理論。但是僅僅依靠腎臟自身極其有限的修復(fù)作用是遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到治療急性腎小管壞死的效果。而目前，臨床上對(duì)急性腎功能衰竭的治療僅僅是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，被動(dòng)的等待腎臟自身的小管上皮細(xì)胞功能恢復(fù)，但由于腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)再生能力極其有限，從而影響了治療效果。因此研究新的促進(jìn)腎小管細(xì)胞功能恢復(fù)的方法，以提高腎臟疾病的治療效果、縮短病程是迫切需要解決的問(wèn)題。最近幾年來(lái)，后腎間充質(zhì)細(xì)胞(metan

3、ephricmesenchymalcells，MMCs)在腎臟修復(fù)再生中的作用越來(lái)越為腎臟病學(xué)者所關(guān)注，有研究證實(shí)在胚胎后腎間充質(zhì)中存在有多能干細(xì)胞，其源自胚胎，無(wú)免疫原性或僅具極低免疫原性，是唯一分化形成腎小管上皮細(xì)胞的原始細(xì)胞。研究還發(fā)現(xiàn)后腎間充質(zhì)細(xì)胞有能力跨越譜系界限形成組織器官功能性細(xì)胞，并表達(dá)組織器官特異性標(biāo)志蛋白，這些研究結(jié)果都顯示后腎間充質(zhì)細(xì)胞在腎臟損傷修復(fù)中具有諸多潛在優(yōu)勢(shì)，很可能成為腎臟修復(fù)再生中功能性腎小管上皮細(xì)胞的

4、重要來(lái)源，后腎間充質(zhì)細(xì)胞移植治療很可能成為改善急性腎小管壞死預(yù)后的重要方法。 目的： 在國(guó)外研究基礎(chǔ)上，改良分離培養(yǎng)大鼠后腎間充質(zhì)細(xì)胞的方法，觀察細(xì)胞生物學(xué)特性，研究后腎間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血再灌注大鼠損傷腎臟的防護(hù)及修復(fù)作用，并探討其可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究后腎間充質(zhì)細(xì)胞移植治療急性腎小管損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.在解剖顯微鏡下顯微分離孕13d(E13d)大鼠胚胎，獲取胚胎后腎并去除輸尿管芽，將胚胎后腎間

5、充質(zhì)組織以直接接種法進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代純化后以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)演變，四唑鹽比色法(MTT)及5-溴脫氧尿嘧啶核苷法(BrdU)觀察細(xì)胞增殖及更新能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD29，CD31，CD34，CD45，CD90，CD166分子的表達(dá)，免疫細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin，Vimeritin，F(xiàn)ibronectin等蛋白的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化(脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)，分別采用油紅O染色及堿性磷酸酶染色觀

6、察誘導(dǎo)分化情況。 2.建立大鼠急性缺血再灌注腎損傷動(dòng)物模型，并隨機(jī)分為MMCs治療組(MMCs)、I/R對(duì)照組(I/R)及假手術(shù)組(Sham)，治療組經(jīng)下腔靜脈給予體外標(biāo)記的培養(yǎng)未分化的后腎間充質(zhì)細(xì)胞，分別于術(shù)后24h、48h、72h、96h處死大鼠檢測(cè)腎功能(BUN、Scr)及腎臟病理改變，原位術(shù)端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡壞死情況，免疫組織化學(xué)染色法觀察凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平，熒光顯微鏡觀察標(biāo)

7、記的MMCs在腎組織中的分布情況。 結(jié)果： 1.培養(yǎng)的MMCs呈貼壁生長(zhǎng)，梭形成纖維細(xì)胞樣，單個(gè)核，核仁大，核漿比大，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，具有自我更新能力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，幾乎所有細(xì)胞都明顯表達(dá)CD29、CD90和CD166，幾乎所有細(xì)胞都不表達(dá)CD31、CD34和CD45；免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示MMCs明顯表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白vimentin和fibronectin，而不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-c

8、adherin；MMCs在特定誘導(dǎo)條件下具有多向分化能力，可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化后的脂肪細(xì)胞油紅O染色呈特異性紅色，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，并可形成鈣結(jié)節(jié)。體外培養(yǎng)的MMCs形狀均一，性狀穩(wěn)定，可以傳多代以上而保持其原有表型不變，說(shuō)明MMCs具有問(wèn)充質(zhì)細(xì)胞表型及干細(xì)胞特性； 2.MMCs移植治療后可以明顯緩解缺血再灌注后急性腎小管損害所引起的腎功能急劇下降，明顯減輕腎臟病理?yè)p害及腎小管上皮細(xì)胞凋亡壞死。血生

9、化結(jié)果顯示，MMCs組的大鼠在再灌注48h血清BUN及Scr值達(dá)到高峰，在隨后的再灌注72h及96h則呈明顯下降趨勢(shì)，而I/R組大鼠在再灌注48h后血清BuN及Scr峰值明顯高于治療組，而且在隨后的再灌注72h及96h也無(wú)明顯下降趨勢(shì)；腎臟病理檢查結(jié)果也顯示，Sham組大鼠腎臟病理無(wú)明顯異常，MMCs及I/R組大鼠腎小球無(wú)明顯病理改變，腎小管均出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫、壞死、脫落、管型形成等病理?yè)p害，但MMCs組大鼠腎小管損傷程度積分明顯

10、低于同時(shí)點(diǎn)I/R組大鼠；TUNEL結(jié)果顯示MMCs組大鼠凋亡及壞死的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量明顯低于同時(shí)點(diǎn)I/R組大鼠，而且免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示，MMCs組大鼠腎臟凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2表達(dá)明顯高于同時(shí)點(diǎn)I/R組大鼠，而B(niǎo)ax表達(dá)則明顯低于同時(shí)點(diǎn)I/R組大鼠，Bcl-2/Bax比值明顯升高。 3.免疫組織熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，MMCs組再灌注24h大鼠腎臟局部未發(fā)現(xiàn)明顯BrdU陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，在再灌注48h腎臟損傷腎小管局部偶爾可見(jiàn)個(gè)別散

11、在BrdU陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，在再灌注72h腎臟損傷腎小管內(nèi)出現(xiàn)較多BrdU陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞，計(jì)數(shù)為[(59.6±6.4)/HP]，再灌注96h腎組織內(nèi)BrdU陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞明顯增多，為[(142.8±8.0)/HP]，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈綠色熒光，主要分布于腎臟外髓質(zhì)及皮髓交界處腎小管中，腎皮質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞很少，腎小球內(nèi)則未見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。有BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的腎小管中，小管內(nèi)腔連續(xù)，無(wú)缺損。 結(jié)論： 1.體外培養(yǎng)的大鼠后