北高叢越橘內(nèi)生真菌的分離、鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、內(nèi)生真菌普遍存在于植物體中，其重要性正日益受到關(guān)注，內(nèi)生真菌是在植物體內(nèi)渡過(guò)全部或部分生活周期，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯的病害癥狀的真菌。不同植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌種類與數(shù)量也不相同，自然界中存在大量的內(nèi)生真菌資源有待開發(fā)?，F(xiàn)已有報(bào)道表明，由藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌，能夠產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的化學(xué)成分。本研究選取北高叢越橘(Vaccinium corymbosum L.)為研究材料，首次進(jìn)行其內(nèi)生真菌資源的研究工作。并通過(guò)形態(tài)學(xué)和

2、分子生物學(xué)方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行了鑒定。同時(shí)對(duì)菌株H2進(jìn)行了次生代謝產(chǎn)物的分離。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.采用組織塊分離法，以PDA和TWA培養(yǎng)基為內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基，在25℃下避光培養(yǎng)，對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以組織塊印跡法對(duì)組織塊表面消毒效果進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果更加可靠，更靈敏。由北高叢越橘的健康葉片中分離得到54株內(nèi)生真菌，其中25株內(nèi)生真菌屬于鏈格孢屬(Alternaria sp.)，22株內(nèi)生真菌屬于擬盤多毛孢屬(Pes

3、talotiopsis sp.)，且分離率較高，分別達(dá)到46％和41％。 2.對(duì)鏈格孢屬內(nèi)生真菌菌株H1和擬盤多毛孢屬內(nèi)生真菌菌株H2進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)曲線幾乎都是近于“S”型，在正常的培養(yǎng)情況下，15天左右可長(zhǎng)滿全皿。為分離提取代謝產(chǎn)物的最佳時(shí)期提供參考。 3.運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步對(duì)菌株H1進(jìn)行了鑒定。采用CTAB法提取DNA。以ITS1和ITS4為引物，對(duì)H1的DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，

4、并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果表明：這種內(nèi)生真菌與已有的鏈格孢屬真菌-豆鏈格孢(Alternaria azukiaein)的同源相似性達(dá)到99％。 4.對(duì)菌株H2的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離和純化。利用硅膠柱層析，以CHCl3:MeOH(10:1至10:10)為洗脫液，分離得到5種化學(xué)成分(C-2，C-3，C-4，C-5，C-6)。通過(guò)薄層層析發(fā)現(xiàn)C-2和C-6與原植物葉片的乙酸乙酯部分具有相同的Rf值。并對(duì)C=6進(jìn)行波譜分析，經(jīng)質(zhì)譜