家蠅蛹中抗腫瘤多肽的分離純化及其作用機理研究.pdf

1、家蠅是一種重要的昆蟲研究資源。從幼蟲到成蟲家蠅都生長在雜菌橫生的環(huán)境中，在人和動物之間傳播病菌，而自身卻很少被感染。家蠅體內存在一系列的生物活性物質。從家蠅蛹或幼蟲中分離純化得到的凝集素已被證實能抑制腫瘤細胞的增殖，然而，關于家蠅蛹多肽及其抗腫瘤活性方面的研究報道卻很少。
　　本實驗通過凝膠過濾層析和離子交換層析從家蠅蛹中分離純化得到一種抗腫瘤多肽(MATP)。Tricine-SDS-PAGE和反相高效液相色譜結果證明MATP是分

2、子量約為18kDa的單一組分。體外增殖抑制實驗結果表明MATP對人肝癌細胞HepG2具有明顯抑制作用，且對人正常肝細胞L-02無明顯抑制作用。HE染色、AO/EB雙染和Hoechst33342/PI雙染觀察發(fā)現(xiàn)經MATP誘導后，HepG2細胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學改變。流式細胞檢測結果表明HepG2細胞被MATP阻滯在S期且凋亡率隨作用時間的延長而升高。
　　熒光染色和免疫印記結果表明MATP誘導HepG2細胞內產生大量ROS從而使

3、MAPK家族中JNK蛋白的磷酸化表達上調，而對ERK和p38蛋白的磷酸化則沒有明顯影響;同時，流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)ROS抑制劑(NAC)與JNK抑制劑(SP600125)預處理后，MATP誘導的HepG2細胞凋亡率降低，證明ROS/JNK參與了MATP誘導的細胞凋亡。另外，免疫印記結果表明MATP下調Akt蛋白的磷酸化表達，從而阻止IκBα降解，但這一變化可能并不依賴于ROS;同時，流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑(LY294002

4、)預處理后，MATP作用的HepG2細胞凋亡率進一步升高，證明Akt也參與了MATP誘導的細胞凋亡。免疫熒光染色和免疫印記結果表明MATP通過JNK蛋白的磷酸化上調和Akt蛋白的磷酸化下調阻止NF-κBp65入核;同時，流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑(PDTC)預處理后，MATP誘導的HepG2細胞凋亡率進一步升高，證明MATP通過JNK和Akt共同阻止NF-κBp65入核誘導細胞凋亡。另外MATP通過阻止NF-κBp65入核下