中藥復方桃紅四物湯對大鼠肝星狀細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本研究旨在觀察中藥湯劑桃紅四物湯直接作用于體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs），對其凋亡的影響，以及桃紅四物湯通過刺激大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌細胞因子,進而在上述兩種細胞組成的共培養(yǎng)體系中對大鼠肝星狀細胞的凋亡產(chǎn)生的影響。
　　方法：骨髓間充質(zhì)干細胞的分離：在無菌條件下分離SD雄性大鼠股骨骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法

2、進行骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)、純化和擴增，傳代至第4代使用。大鼠肝星狀細胞系（HSC-T6）復蘇后傳代使用。用6孔塑料細胞培養(yǎng)板，在半透膜(transwell insert)上層接種骨髓間充質(zhì)干細胞(2×105cells/well),在下層接種大鼠肝星狀細胞(2×105cells/well),建立上下雙層細胞共培養(yǎng)體系，常規(guī)培養(yǎng)。實驗分四個組：大鼠肝星狀細胞空白對照組即大鼠肝星狀細胞單獨培養(yǎng)；大鼠肝星狀細胞用藥刺激組用桃紅四物湯藥液含量為1

3、0％、15%、20%的完全培養(yǎng)基，直接作用于大鼠肝星狀細胞24小時；空白共培養(yǎng)組常規(guī)共培養(yǎng)；加藥刺激共培養(yǎng)組用桃紅四物湯藥液含量為10%、15%、20%的完全培養(yǎng)基刺激大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞3小時后，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與大鼠肝星狀細胞共培養(yǎng)24小時。大鼠肝星狀細胞直接用藥組：以正常單獨培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞作為對照，于倒臵相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)，用噻唑藍（MTT）法檢測桃紅四物湯對大鼠肝星狀細胞的增殖抑制率。用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reve

4、rse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測大鼠肝星狀細胞的凋亡相關(guān)基因Bax mRNA和凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA表達變化，DNA凝膠電泳（DNA Ladder）法檢測大鼠肝星狀細胞凋亡。加藥共培養(yǎng)組：以正常空白共培養(yǎng)組作為對照比較。通過RT-PCR法和DNA Ladder法檢測各組大鼠肝星狀細胞的凋亡情況及骨髓間充質(zhì)干細胞的肝細胞生長因子基因（HGF mRNA）表

5、達情況，并用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測共培養(yǎng)上清液中肝細胞生長因子濃度。
　　結(jié)果：MTT法檢測，桃紅四物湯直接刺激組，大鼠肝星狀細胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制（P<0.01），且呈現(xiàn)濃度依賴性，與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.05）。RT-PCR法檢測，直接刺激組大鼠肝星狀細胞的Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表達與空白對照組比較，有明顯差異(P<0.05），且隨藥物濃度升高而增減，加藥刺激共培養(yǎng)組大鼠肝星狀細胞的B

6、ax mRNA和Bcl-2 mRNA表達與空白共培養(yǎng)組比較，有明顯差異（P<0.05），且隨藥物濃度升高而增減，共培養(yǎng)各組間大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的肝細胞生長因子基因(HGF mRNA）的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。DNA Ladder法檢測，直接刺激組、加藥刺激共培養(yǎng)組和空白共培養(yǎng)組中的大鼠肝星狀細胞出現(xiàn)了明顯的DNA Ladder條帶，空白對照組的大鼠肝星狀細胞未出現(xiàn)DNA Ladder條帶。ELISA法檢測，加藥刺激共培養(yǎng)