全反式視黃酸作用人肝癌細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)及其通過上調(diào)profilin1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制的研究.pdf

1、全反式視黃酸(all-transretinoicacid，atRA)是目前公認(rèn)的對白血病可以起到有效治療作用的藥物，近些年來，鑒于其在多種類型的白血病中的療效，很多學(xué)者也嘗試將其應(yīng)用于實體腫瘤的治療，并且取得了一定成果，肝癌也在其中之列。但目前對于atRA對肝癌的腫瘤抑制機(jī)制仍不完全清楚，哪些蛋白質(zhì)在此過程中起到關(guān)鍵作用值得進(jìn)一步的探討。 在本論文研究中，通過雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrop

2、horesis，2-DE)來尋找在atRA作用肝癌細(xì)胞后發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)，并通過質(zhì)譜技術(shù)(massspectrometry,MS)對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。本實驗以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作為研究對象，用20μMatRA處理SMMC-7721細(xì)胞48小時后，應(yīng)用2-DE對atRA處理組和對照組細(xì)胞的總蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了分析，對照組平均檢測到925~105個蛋白點(n=3)，atRA處理組平均檢測到970-~：33個蛋白點(n=3)。

3、將平行的對照組和atRA處理組的蛋白圖譜進(jìn)行匹配分析，平均匹配點數(shù)為690-~94個(n=3)，平均匹配率為72．47％。并通過比對分析發(fā)現(xiàn)了5個atRA處理后上調(diào)的蛋白質(zhì)點和16個處理后下調(diào)的蛋白質(zhì)點。然后選擇了6個差異顯著(變化倍數(shù)>2)的蛋白質(zhì)，通過質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行了鑒定。這6個蛋白質(zhì)分別為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白profilin1和F-actin加帽蛋白α1亞基，參與能量代謝的酶類物質(zhì)磷酸甘油酸激酶1、α-烯醇化酶和吡哆醛激酶

4、剪切異構(gòu)體1以及核內(nèi)蛋白RuvB-like1，這些蛋白質(zhì)在atgA對腫瘤作用中的意義何在值得探討。由于已有部分文獻(xiàn)報道細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白profilin1可能參與了腫瘤細(xì)胞的生長、分化、遷移等過程，因此本論文選擇了atRA上調(diào)蛋白profilin1作為進(jìn)一步研究的重點。 首先對通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到的profilin1變化結(jié)果進(jìn)行了驗證。通過Westernblot實驗證明了profilin1的蛋白表達(dá)水平隨著atRA作用劑量由5g

5、m至20gM的增加和作用時間由12至48小時的延長而逐漸升高，提示profilin1的表達(dá)對atRA具有劑量和時間依賴性。同時，我們也選取了除SMMC-7721外的另三株肝癌細(xì)胞BEL-7402、BEL-7404和HepG2與正常肝細(xì)胞永生化細(xì)胞株L02細(xì)胞，對其中profilin1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721、BEL-7402、BEL-7404和HepG2肝癌細(xì)胞中profilin1的表達(dá)水平分別低于正常肝細(xì)胞永生

6、化細(xì)胞L02中的表達(dá)水平52％、53％、38％和35％，證明profilin1的蛋白表達(dá)在多株肝癌細(xì)胞中均受顯著抑制。 為了解profilin1在atRA的腫瘤抑制過程中的作用，我們對atRA處理和過表達(dá)profilinl后肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，以及分化相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行了初步的研究。首先通過瞬時轉(zhuǎn)染profilin1表達(dá)質(zhì)粒而使SMMC-7721細(xì)胞中profilinl過表達(dá)，然后對過表達(dá)profilin1的肝癌細(xì)胞、atRA

7、處理組以及對照組的SMMC-7721細(xì)胞的增殖和遷移能力、甲胎蛋白(AFP)含量和酪氨酸-(g-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)活力進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，atRA可以顯著抑制細(xì)胞增殖和遷移，降低細(xì)胞內(nèi)AFP含量約7796、增強TAT活力4倍以上，而過表達(dá)profilin也能夠明顯抑制細(xì)胞增殖和遷移，降低細(xì)胞內(nèi)AFP含量約4096，增強TAT活力約2596。根據(jù)以上結(jié)果可推測，profilin1參與了atRA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移抑制過程，atRA