木犀草素對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬在細(xì)胞水平探討血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial Cells，VECs)與血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)非接觸式共培養(yǎng)促進(jìn)VSMCs增殖和遷移的作用，觀察木犀草素(Luteolin，Lut)是否可以通過(guò)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VECs功能障礙從而阻斷共培養(yǎng)體系中VSMCs的增殖和遷移，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)

2、行初步探討。
　　方法：1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-C，購(gòu)自ATCC)。2、組織貼塊法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)，并進(jìn)行平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(SM-α actin)免疫組化鑒定，取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3、建立VECs/VSMCs非接觸式共培養(yǎng)體系，AngⅡ刺激的VECs種于下室，VSMCs種于上室。實(shí)驗(yàn)分組為(1)VECs/VSMCs對(duì)照組；(2)AngⅡ

3、組；(3)Lut濃度梯度組(12.5μ M、25μ M、50μ M)；(4)Ly294002組(10μ M)。4、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中VSMCs的遷移；噻唑藍(lán)(3-(4，5，-dimethylthiazol-2-yl)-2，5，-diphenyl，MTT)比色法檢測(cè)共培養(yǎng)體系中VSMCs的增殖；免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)測(cè)定TotalAkt，Phospho-Akt，VEGF，NOX4蛋白表達(dá)的情況；ELISA

4、試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清VEGF水平。
　　結(jié)果：1、原代培養(yǎng)的VSMCs生長(zhǎng)良好，光鏡下呈長(zhǎng)梭形及“峰與谷”樣生長(zhǎng)。SMα-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的VSMCs特征。2、AngⅡ刺激的VECs能明顯促進(jìn)共培養(yǎng)體系中VSMCs的增殖和遷移，Lut預(yù)處理能顯著抑制VSMCs的增殖和遷移，以50uM最為顯著。Ly294002預(yù)處理辦能顯著抑制VSMCs的增殖和遷移。3、AngⅡ可明顯促進(jìn)VECs表達(dá)Phospho-AK

5、T、VEGF、NOX4蛋白。Lut能顯著抑制VECs表達(dá)Phospho-AKT、VEGF、NOX4蛋白，各濃度組時(shí)間組間差異顯著；Ly294002亦可顯著抑制Phospho-AKT、VEGF蛋白的表達(dá)。4、VEGF含量Elisa法檢測(cè)結(jié)果顯示：VECs有基礎(chǔ)VEGF分泌，AngⅡ可誘導(dǎo)VECs分泌VEGF。Lut和Ly294002均可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)VECs分泌VEGF。
　　結(jié)論：1、Lut顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VECs/VS

6、MCs共培養(yǎng)體系中VSMCs的增殖和遷移。2、Lut顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中NOX4的表達(dá)，提示其可能通過(guò)抑制NOX4表達(dá)阻斷ROS的產(chǎn)生發(fā)揮抗內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用。3、Ly294002能抑制AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)并顯著抑制共培養(yǎng)體系中VSMCs增殖和遷移，提示AngⅡ可通過(guò)P13K/AKT通路誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，表明AngⅡ-PI3K/Akt通道及VEGF在VECs功能障礙與VSMCs增殖和遷移的對(duì)話中起著重要