利用誘導型多能干細胞及轉分化技術建立癲癎疾病模型的研究.pdf

1、【研究背景】
　　在分化的體細胞中過表達特定的轉錄因子可將其重編程為多能性干細胞。通過這種方法建立的病人特異性多能干細胞(Induced pluripotent stem cell,iPS),避免了移植產生的排斥反應,且繞開了胚胎干細胞因破壞胚胎所帶來的倫理學問題。轉分化可將一種終末分化細胞轉分化為另一種終末分化細胞,通過在體細胞中強制性表達外源基因可將其直接轉化為包括神經元在內的多種細胞類型。
　　嬰兒期嚴重肌陣攣性癲癎(

2、SMEI,也被稱為Dravet綜合征)和全面性(遺傳性)癲癎伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)兩者都可以由SCN1A基因的突變引起,該基因編碼NaV1.1電壓門控鈉通道的α1亞基。GEFS+的疾病頻譜包括了輕度至重度一系列的表型,其中最嚴重的表現(xiàn)是嚴重高熱驚厥綜合征,即Dravet綜合癥(也稱SMEI)。目前對于SMEI確切的致病機理尚不清楚,且沒有有效治療藥物。此外,一些常規(guī)抗癲癎藥物的使用還可導致其病情加重。
　　【研究目的】

3、r>　　通過iPS技術及轉分化技術對Dravet綜合癥患者進行體外建模,初步探討發(fā)病機理,并進行初步藥物篩選。
　　【材料與方法】
　　本研究通過兩種途徑將病人的成纖維細胞轉變?yōu)槌墒斓纳窠浽?一是通過將病人的成纖維細胞重編程為多能性干細胞,體外將其分化為成熟的神經元;二是將病人的成纖維細胞直接轉分化為成熟的神經元。
　　1.通過將OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC四種轉錄因子導入Dravet綜合癥及GEFS+病人

4、的成纖維細胞中,建立了30多株細胞系,并通過免疫熒光染色,核型分析,畸胎瘤實驗及芯片分析等鑒定其多能性。
　　2.將Dravet綜合癥,GEFS+病人及正常對照組hES體外定向分化為成熟的谷氨酰胺能及GABA能神經元,并通過免疫熒光染色及電生理活動等方法進行鑒定。
　　3.通過在病人的成纖維細胞中過表達六種轉錄因子(ASCL1、BRN2、MYT1、NEUROD1、OLIG2和ZIC1)成功將其直接轉分化為谷氨酰胺能及GABA

5、能神經元,并進行免疫熒光染色及Na通道活動等電生理檢測。
　　4.通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在體外分化的神經元中,90％以上都是谷氨酰胺能神經元,其余為GABA能神經元;大部分轉分化的神經元也都是谷氨酰胺能神經元,少數(shù)為GABA能神經元。
　　5.通過生物素(Biocytin)標記電生理記錄過的神經元,并通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),所記錄的神經元都為谷氨酰胺能的神經元。
　　【結果】
　　1.成功的建立了Dravet綜合癥

6、及GEFS+病人的iPS細胞系,通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)其可表達OCT4,SOX2,TRA-1-60。畸胎瘤實驗發(fā)現(xiàn)Dravet綜合癥及GEFS+病人的iPS細胞形成的畸胎瘤可分化為三個胚層。核型檢測發(fā)現(xiàn)病人的iPS都具有正常核型?；蛐酒Y果分析發(fā)現(xiàn)病人的iPS細胞系基因表達與人類胚胎干細胞類似。
　　2.成功的將Dravet綜合癥及GEFS+病人的iPS細胞系體外定向分化為成熟的且有功能的谷氨酰胺能神經元。這些神經元可表達神經元的

7、標志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)其具有Na、K電流,動作電位及興奮性突觸后電流(mEPSC)。
　　3.通過檢測其Na通道活動發(fā)現(xiàn),Dravet綜合癥病人體外分化的神經元Na電流變大,Na通道失活延遲,動作電位強度及頻率明顯增強,具有自發(fā)性癲癎樣放電及陣發(fā)性去極化偏移(PDS)。
　　4.通過將抗癲癇藥物苯妥英鈉處理Dravet綜合癥病人iPS體外分化神經元發(fā)現(xiàn),其N

8、a電流變小,動作電位強度及頻率減小,自發(fā)性陣發(fā)性去極化偏移現(xiàn)象消失,在一定程度上緩解其Na通道的過度興奮性。
　　5.成功的將Dravet綜合癥及GEFS+患者的成纖維細胞在體外直接轉分化為成熟的且有功能的神經元,這種神經元可表達神經元的標志物TUJ1,MAP2,GAD67,vGLUT1及SYNAPSIN,并通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)其具有Na、K電流,動作電位。
　　6.通過電生理功能檢測發(fā)現(xiàn)Dravet綜合癥患者直接轉分化神經元

9、,發(fā)現(xiàn)其Na通道失活延遲,這與iPS體外分化神經元的病理表型相一致。
　　【結論】
　　1.建立了Dravet綜合癥及GEFS+病人的誘導型多能干細胞系,并將其定向分化為成熟且有功能的神經元。
　　2.通過轉分化技術將Dravet綜合癥及GEFS+病人的成纖維細胞直接轉分化為成熟且有功能的神經元。
　　3.利用iPS技術及轉分化技術建立了Dravet綜合癥及GEFS+疾病模型。
　　4.利用iPS體外分化的