泰山松化粉多糖的成分分析及其對B亞群禽白血病的免疫調(diào)理作用.pdf

1、禽白血病(Avian Leucosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus，ASV)群中的病毒感染引起的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。該病在蛋雞、肉雞以及我國地方品系雞群中都有發(fā)生，造成雞群生產(chǎn)性能降低、免疫抑制、腫瘤性死亡等危害，尤其是ALV感染引起的亞臨床感染，導(dǎo)致感染雞生產(chǎn)性能低下和免疫抑制，從而引起其它病毒和細菌的混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致繼發(fā)感染或共感

2、染，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。對于禽白血病的防制，目前尚缺乏有效的藥物和疫苗，只能通過種群凈化來實現(xiàn)對該病的控制。在過去的幾十年中，由于未能采取有效地凈化措施，禽白血病在養(yǎng)禽地區(qū)廣泛的流行和散播，致使對其防控更加耗時耗力。因此，亟需探索新的方法控制ALV的散播、減少感染ALV感染的亞臨床癥狀，減少該病帶來的危害。目前，多種植物多糖作為新型的添加劑被證明有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等多種生物學(xué)作用。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖

3、(Taishan pine pollen polysaccharose，TPPPS)能顯著增強奇異變形桿菌和禽波氏桿菌亞單位疫苗的免疫效果，促使更強的免疫應(yīng)答反應(yīng);提高獺兔的生產(chǎn)性能;對免疫抑制小鼠有免疫恢復(fù)作用。然而，前面所用TPPPS為水提醇沉法所提的總多糖，至今仍不清楚TPPPS中的有效活性成分及相應(yīng)的生物學(xué)特性，因此限制了人們對TPPPS的認識及應(yīng)用。
　　基于以上考慮，本研究首先分析了TPPPS的成分和理化特性，并鑒定了

4、每種成分的生物學(xué)活性;進一步對不同組份抑制B亞群禽白血病病毒(ALV-B)增殖的特性進行了分析;最終，通過建立感染感染ALV-B的雞免疫抑制模型，探究了TPPPS對ALV-B誘導(dǎo)的免疫抑制的免疫調(diào)理和恢復(fù)作用，為探索研發(fā)防制禽白血病的新途徑奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三部分內(nèi)容:
　　1.TPPPS部分理化特性和生物學(xué)活性的分析
　　1.1 TPPPS的柱層析純化及各組分分子量和單糖組成的檢測
　　為進一步研究TPPPS的功

5、能和發(fā)揮作用的機理，本研究將粗提的多糖用DEAE纖維素柱和Sephadex G-200凝膠柱進一步的純化。結(jié)果顯示，松花粉多糖主要包括三種組分（分別命名為TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3），并且分離得到了這三種組分的均一多糖。
　　利用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和高效液相色譜(HPLC)檢測三種多糖組分的分子量和單糖組成。結(jié)果表明TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3的分子量分別為56、25和128 kDa。TPP

6、PS由甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等構(gòu)成，TPPPS1-3組分之間各單糖組成的種類和比例存在明顯不同。以上研究結(jié)果提示這三種組份可能具有不同的生物學(xué)特性。
　　1.2 TPPPS體外抗氧化性、免疫增強活性、抗病毒活性的檢測
　　TPPPS各組分的分子量和單糖組成差異顯著，表明TPPPS1-3的生物學(xué)活性可能存在明顯的差異。為了進一步了解TPPPS的生物活性，本研究對TPPPS、TPPP

7、S1、TPPPS2和TPPPS3的三種體外生物活性進行了檢測。結(jié)果表明，TPPPS2和TPPPS3顯著促進脾淋巴細胞的增殖，并且TPPPS3的效果強于TPPPS2; TPPPS3增強細胞因子白介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子（TNF）的分泌，而TPPPS2僅可以顯著提高IL-2的分泌;值得注意的是，TPPPS1沒有以上作用，但誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的效果最為顯著，表明TPPPS1具有最顯著的抗氧化活性;50μg/mLTPPPS3對ALV-B增殖作

8、用最為顯著，并且作用的主要時期是在病毒的吸附期。本研究為使用TPPPS1-3合理比例的進一步研究可促進有效的免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)和分析TPPPS的體外的抗病毒機制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.TPPPS體外抗病毒活性機制的分析
　　2.1阻斷ELISA方法的建立
　　為研究TPPPS對ALV-B增殖的顯著抑制主要發(fā)生在病毒吸附宿主細胞的過程中的機制，本研究根據(jù)ALV-B的吸附過程中起重要作用的兩個蛋白，病毒的囊膜糖蛋白gp85和宿

9、主的受體蛋白tv-b，建立兩個ELISA方法。用原核表達的方法表達出gp85和tv-b蛋白，并制備這兩個蛋白的多克隆抗體，用這兩個蛋白和抗體建立兩個受體-病毒ELISA方法（方法Ⅰ:gp85—tv-b—tv-b抗體—酶標二抗;方法Ⅱ:tv-b—gp85—gp85抗體—酶標二抗）。用方陣試驗確定ELISA方法的各個條件，結(jié)果顯示方法Ⅰ中g(shù)p85，tv-b，tv-b抗體的濃度，陰陽性臨界值分別是16μg/mL，32μg/mL，1∶80，0.

10、178，方法Ⅱ中tv-b，gp85，gp85抗體的濃度分別是32μg/mL，32μg/mL，1∶80，0.194，封閉液和TMB顯色時間都是5％脫脂奶粉和15 min。本試驗成功建立兩個ELISA方法用于分析TPPPS體外抗病毒活性機制。
　　2.2 TPPPS體外抗病毒活性機制的分析
　　利用建立的兩個受體-病毒ELISA方法，在gp85蛋白（或tv-b蛋白）包被ELISA板之后加入200μL不同濃度(100，101，10

11、2，103，104，105μg/mL)的TPPPS3溶液孵育，進行后續(xù)試驗觀察結(jié)果的變化。結(jié)果顯示，TPPPS3可以顯著降低ELISA方法Ⅰ中的P/N值，對方法Ⅱ的影響不顯著，這表明多糖能與病毒的gp85蛋白的結(jié)合，并且不能與tv-b受體蛋白結(jié)合，這種結(jié)合干擾了病毒與tv-b受體蛋白的結(jié)合，這是TPPPS抑制了病毒擴增的機制之一。本研究為進一步認識TPPPS在ALV-B吸附宿主細胞過程中的作用，為研究TPPPS抑制ALV-B在雛雞體內(nèi)增

12、殖的機制奠定基礎(chǔ)，為TPPPS在禽白血病防制方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。
　　3.TPPPS對感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的調(diào)理作用
　　3.1感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的建立
　　雞群感染ALV后可造成1-2％的死亡率（偶爾可達20％或更高），而大部分雞只有亞臨床感染，主要是表現(xiàn)是生產(chǎn)性能下降和免疫抑制。本研究選用50只1日齡雛雞感染ALV-B，分別在感染后1-9周監(jiān)測感染雞的各項生理指標的變化，建立免疫抑制模型，檢

13、測指標包括:發(fā)病率與死亡率，體重與免疫器官指數(shù)，抗ALV-B特異性抗體水平，γ干擾素(IFN-γ)與白介素2(IL-2)水平，T淋巴細胞增殖率，CD4+和CD8+淋巴細胞亞群比例等。結(jié)果顯示通過對以上指標的檢測未發(fā)現(xiàn)感染雞死亡，但其生長狀況顯著差于正常雞，并且免疫器官發(fā)育遲緩，免疫反應(yīng)不明顯，淋巴細胞活性降低，CD4+和CD4+/CD8+顯著下降等。結(jié)果表明，感染雞的免疫系統(tǒng)受到顯著地免疫抑制，免疫抑制模型建立成功，為分析感染ALV-B

14、雛雞的免疫反應(yīng)變化提供了依據(jù)。
　　3.2 TPPPS對免疫抑制模型雛雞的調(diào)理作用
　　據(jù)報道TPPPS對環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫抑制小鼠有免疫恢復(fù)作用，本研究通過給感染ALV-B的免疫抑制模型雛雞頸部皮下注射TPPPS，分析多糖對免疫抑制雞的免疫調(diào)理作用，同時在雛雞一周齡后免疫新城疫病毒(NDV)疫苗，之后檢測各項免疫指標，用以分析TPPPS對感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的調(diào)理恢復(fù)作用。研究結(jié)果顯示，TPPPS組雛雞的體重和免