rhBMP-6的表達、純化與鑒定-BMP-6抗纖維化及抗氧化應(yīng)激作用與機制初探.pdf

1、第一部分 rhBMP-6的表達、純化與鑒定
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogentic protein,BMP)屬于TGF-β蛋白超家族(BMP-1缺乏碳段保守結(jié)構(gòu)而除外)。BMP-6為BMP家族成員之一,與其它成員相比,BMP-6有較強的骨誘導(dǎo)作用。BMP-6在骨折愈合過程中表達上調(diào),并在不同的骨缺損模型中,能加快缺損骨的修復(fù)。另外,系統(tǒng)給予BMP-6能有效治療實驗性骨質(zhì)疏松引起的骨量減少和骨微觀結(jié)構(gòu)的改變,提示

2、BMP-6對骨缺損和骨質(zhì)疏松有潛在的治療作用。本研究分別采用大腸桿菌和培養(yǎng)哺乳動物細胞為表達系統(tǒng),通過基因工程途徑獲取具有生物活性的BMP-6蛋白。
　　 1.BMP-6在大腸桿菌的表達、復(fù)性與純化
　　 以非融合形式分別在大腸桿菌胞質(zhì)中表達不同截短模式,同時帶有克隆位點引入氮端延伸序列(MA.或MG)的BMP-6單體蛋白或BMP-6突變體(Ala56-His)。表達菌株與表達條件篩選試驗發(fā)現(xiàn)序列MA-BMP-6(132

3、3)的表達量較高。因此選用MA-BMP-6(1323)在大腸桿菌BL-21(DE3)中表達BMP-6成熟肽單體蛋白。
　　 誘導(dǎo)表達后,BMP-6約占菌體總蛋白的20％,以包涵體形式存在。包涵體分離純化后,獲得組成均一的BMP-6單體蛋白。溶解試驗發(fā)現(xiàn)高濃度變性劑(6MGdn-HCI)合并還原劑(0.1M DTT)能有效溶解包涵體蛋白。經(jīng)溶解、折疊、添加劑試驗逐步篩選、優(yōu)化復(fù)性條件后,約10%蛋白形成同源二聚體。BMP-6突變體

4、對二聚體的形成沒有顯著影響。復(fù)性所得二聚體蛋白能夠通過反相色譜純化?？赡苡捎谌狈μ腔壒?純化的二聚體蛋白堿性磷酸酶誘導(dǎo)活性的量效關(guān)系不顯著。
　　 2.BMP-6在CHO細胞中的表達、純化與鑒定
　　 將含BMP-6信號肽、前肽和成熟肽以及含BMP-2信號肽、前肽與BMP-6成熟肽融合的基因序列分別克隆至哺乳動物細胞表達載體。利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染分析發(fā)現(xiàn)BMP2/6融合基因能有效分泌表達BMP-6蛋白。
　　

5、然后采用二氫葉酸還原酶(Dihydroflolate reductase,DHFR)缺失的中華倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)細胞為宿主,通過混合克隆、單克隆篩選以及目的基因擴增后,獲得表達水平約20 ng/106 cells/24 h的穩(wěn)定表達細胞株。對穩(wěn)定表達細胞株的比生長速率,BMP-6的比生成速率與分泌特性,以及BMP-6在培養(yǎng)環(huán)境與條件培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性進行了初步研究。條件培養(yǎng)基中的B

6、MP-6通過肝素親和色譜與反相色譜分離純化,對純化產(chǎn)物的純度和生物活性進行了鑒定。
　　 最后,純化產(chǎn)物劑量和時間依賴地誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性。與對照相比,BMP-6在濃度為25 ng/ml時活性顯著,在400 ng/ml時達到最大反應(yīng)劑量,而半數(shù)有效量介于100-150 ng/ml。用50 ng/ml的BMP-6處理細胞三天,堿性磷酸酶活性與對照相比差異顯著。
　　 結(jié)論:本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng),以非融合包涵體形式表達

7、BMP-6單體蛋白,通過優(yōu)化表達、體外氧化復(fù)性和純化獲得成熟肽二聚體;同時采用CHO細胞分泌表達BMP-6,通過載體優(yōu)化、細胞株篩選、純化流程建立等途徑獲取具有顯著生物活性的BMP-6蛋白。
　　 第二部分 BMP-6抗纖維化和氧化應(yīng)激的作用與機制
　　 除骨誘導(dǎo)作用外,BMP-6還參與機體發(fā)育和成體組織器官重塑過程的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)慢性腎損傷時BMP-6表達下調(diào),而慢性腎損傷直接抑制骨形成,提示抑制腎損傷可能能夠促進骨形

8、成。因此本文對BMP-6的抗腎纖維化以及抗氧化應(yīng)激作用與機制進行研究。
　　 1.BMP-6抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PTEC轉(zhuǎn)化
　　 腎間質(zhì)纖維化是慢性腎損傷的主要特征而TGF-β1在其中發(fā)揮重要作用。TGF-β1能誘導(dǎo)人近曲小管上皮細胞(Proximal tubular epithelial cell,PTEC)HK-2細胞增殖抑制、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和黏附性增加,能誘導(dǎo)Fibtonectin和TIMP-2(Tissuein

9、hibitors of metalloproteinase-2)表達,而抑制MMP-2(Ma,trix metalloproteinase2)的表達和活性。同時,TGF-β1能激活Smad3和JNK激酶信號途徑。BMP-6單獨處理時,對HK-2細胞的增殖、形態(tài)表型、胞外基質(zhì)蛋白的合成以及黏附性無明顯影響。但是BMP-6能抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細胞增殖抑制,形態(tài)、表型轉(zhuǎn)化,胞外基質(zhì)蛋白的堆積以及黏附性增加,同時能抑制TGF-β1誘導(dǎo)

10、的Smad3和JNK激酶的激活。本文研究證實BMP-6能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化作用,這種作用可能是通過抑制JNK激酶和Smad3信號途徑的活化而實現(xiàn)。
　　 2.BMP-6通過Smad5途徑誘導(dǎo)HO-1表達而抗PTEC氧化應(yīng)激損傷
　　 研究發(fā)現(xiàn)氧自由基參與TGF-β1誘導(dǎo)的PTEC轉(zhuǎn)化而血紅素氧合酶1(hemeoxygonase1,HO-1)是機體抗氧化應(yīng)激的重要機制。BMP-6能劑量和時間依賴地抑制雙氧水誘導(dǎo)的

11、HK-2細胞氧化應(yīng)激損傷,以及誘導(dǎo)HO-1表達。HO-1誘導(dǎo)、過表達以及HO-1產(chǎn)物膽紅素或一氧化碳能減輕HK-2細胞的氧化應(yīng)激損傷,而新基因合成抑制、HO-1活性抑制、HO-1基因干擾或一氧化碳捕獲等能減弱BMP-6的抗氧化應(yīng)激作用。BMP-6能激活Smad5途徑,而Smad5基因干擾則抑制HO-1的誘導(dǎo)表達。HO-1啟動子上Smad5結(jié)合位點缺失或突變能抑制BMP-6誘導(dǎo)的HO-1啟動子活性增加。最終證實BMP-6通過Smad5途徑