人低氧誘導因子1α及其突變型重組腺病毒載體的構建.pdf

1、缺血性心臟病目前治療主要是常規(guī)的藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(CABG)，然而相當一部分患者藥物治療難以見效，也不適于常規(guī)血運再通術處理，所以必須尋求其它方法。近年來，隨著分子生物學技術的進步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運重建術中具有發(fā)展前景的新方向。促血管生長因子研究較多的有VEGF、FGF等，雖然Ⅰ期臨床試驗結果證明安全有效，但Ⅱ期臨床試驗結果并不理想，資料顯示VEGF可導致血管滲漏、組織水腫等，F(xiàn)GF治

2、療則與蛋白尿有關。血管生長過程本身受一系列生長因子的調節(jié)，單個生長因子治療并不足以誘導成熟的血管新生。低氧誘導因子-1(hypoxiainduciblefactor1,HIF-1)是細胞對低氧/缺氧作出適應性反應的關鍵性轉錄因子，通過對VEGF等多種靶基因的轉錄調控參與了血管新生、紅細胞生成等病理生理過程。HIF-1α是其亞單位，決定HIF-1的活性。然而HIF-1α常氧下容易降解，主要與常氧狀態(tài)下HIF-1αODD區(qū)Pro564和Pr

3、o402發(fā)生羥基化有關，突變其中任一位點的單突變型HIF-1α在常氧下都可以得到表達。臨床前期研究表明，應用具有組成型表達活性的HIF-1α基因治療可誘導生理功能完整的血管新生?；蜣D移載體中質粒載體由于其轉染效率低很難在靶細胞得到目的基因高表達，腺病毒載體較其他病毒載體具有制備容易、感染譜廣、病毒滴度高、不引起插入突變等優(yōu)點而成為治療性血管新生最具臨床應用價值的載體之一。因此，我們在業(yè)已完成對HIF-1αPro564定點突變及表達分析

4、基礎上，擬構建能在哺乳動物細胞得到外源基因高表達的攜帶HIF-1α及HIF-1αAla564基因的重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α及Adeno-HIF-1αAla564，為進一步研究HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應用奠定基礎。 目的構建能在哺乳動物細胞得到外源基因高表達的攜帶HIE-1α及其突變型HIF-1αAla564基因的重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α及Adeno-HIF-1

5、αAla564，為進一步研究HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應用奠定基礎。 方法采用體外連接的重組腺病毒方法，由表達質粒pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α及pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1αAla564通過KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切獲得包括起始密碼子在內(nèi)的HIF-1α及HIE-1αAla564的cDNA片段，通過pcDNA3.1(+)分別克隆至穿梭質粒pShuttle2的人

6、巨細胞病毒啟動子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點間，以PI-SceⅠ和Ⅰ-CeuⅠ雙酶切重組穿梭質粒，獲得含有HIF1α及其突變型cDNA的表達盒，通過體外連接法與線性化的腺病毒骨架質粒Adeno-XViralDNA連接，重組成pAdeno-HIF1α及pAdeno-HIF1αAla564腺病毒質粒，再分別經(jīng)PacⅠ酶切線性化并暴露其兩端的反向重復序列(ITRs)，純化后以Lipofectamine200

7、0轉染低代HEK293細胞，包裝出帶有目的基因表達盒的重組腺病毒Adeno-HIF1α及Adeno-HIF1αAla564。同時重組腺病毒對照質粒pAdeno-laZ，轉染HEK293細胞，行X-gal原位細胞染色觀察轉染效率。重組病毒行PCR鑒定、擴增及滴度測定。 結果經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實重組穿梭質粒及重組腺病毒質粒構建成功，pShuttle2-HIF1α及pAdeno-HIF1α質粒中HIF1αcDNA564位均為脯氨酸

8、(Pro)密碼子CCC，而突變型pShuttle2-HIF1αAla564及pAdeno-HIF1αAla564質粒564位則為丙氨酸(Ala)密碼子GCC。對照質粒pAdeno-laZ轉染HEK293細胞X-gal染色顯示轉染效率約20％。包裝后反復凍融細胞3次得到含重組病毒的病毒液，擴增病毒后提取病毒DNA行PCR檢測重組腺病毒均得到預期的287bp擴增產(chǎn)物，終點稀釋實驗法檢測重組腺病毒Adeno-HIF1α和Adeno-HIF1α