臨床白念珠菌耐藥的分子機制研究.pdf

1、近年來,深部真菌感染明顯增加,其中白念珠菌是深部真菌感染中最為常見的致病菌。由于三唑類抗真菌藥物尤其是氟康唑(Fluconazole)療效確切,耐受性好,因而在臨床上廣泛應用。隨著氟康唑長療程使用,因出現(xiàn)耐藥株而導致治療失敗的報道與日俱增。目前已確定的白念珠菌主要耐藥機制包括：主要易化載體超家族蛋白MDR1基因的過表達；編碼ABC轉運蛋白的CDR1,CDR2基因的高表達；藥物作用靶酶基因ERG11的高表達和突變等。CAP1基因編碼的Ca

2、plp是MDR1的轉錄激活因子,在白念珠菌的氧化應激反應中發(fā)揮重要的調控的作用。TAC1基因編碼的Taclp是CDR1,CDR2的重要轉錄激活因子。CAP1可介導MDR1基因的上調和持續(xù)性高表達,而TAC1可介導CDR1、CDR2基因的上調和持續(xù)性高表達,最終產生耐藥性。 本課題研究的目的是明確長海醫(yī)院自臨床患者中分離的白念珠菌對氟康唑等抗真菌藥物產生耐藥性的分子機制,了解菌株產生耐藥性的內在原因,尋找對這些耐藥菌株耐藥性產生的

3、重要的分子機制,為預測菌株耐藥性產生奠定理論基礎。 采用微量液基稀釋法測定氟康唑對臨床分離白念珠菌的最低抑菌濃度；以篩選出敏感菌株和耐藥菌株；實時定量PCR(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)方法檢測耐藥相關基因CDR1,CDR2,MDR1,ERG11,轉錄調控因子CAP1及TAC1的表達水平；用羅丹明6G外排實驗檢測羅丹明6G在CDR1,CDR2基因表

4、達差異的白念珠菌中的外轉運情況；以抽提的白念珠菌基因組DNA為模板,對ERG11,TAC1,CAP1基因的編碼序列進行PCR擴增,獲得全長片段并測序,利用NCBIDatabase和Candida Genome Database提供的BlastN和BlastX方法進行比對,尋找是否存在有意義的突變。 本課題研究證實臨床耐藥菌株中耐藥相關基因CDR1、CDR2、MDR1的高表達與其耐藥性產生密切相關；轉錄因子TAC1高表達調控CDR

5、1基因的高表達,是CDR1高表達引起菌株耐藥性產生的重要原因。羅丹明6G外轉運實驗證明CDR1、CDR2基因的高表達引起藥物外轉運增加,是菌株耐藥性產生的重要原因。ERG11變異的檢測只發(fā)現(xiàn)有D116E,E266D兩個位點的變異與耐藥性產生密切相關,未檢測到國內外其他文獻中提及的其他變異。而對CAP1和TAC1的測序未發(fā)現(xiàn)與耐藥性產生密切相關的變異位點,說明轉錄因子的變異可能不是耐藥性產生的重要原因。 本課題研究的部分菌株中,確