湖南人群非綜合征性耳聾GJB2(Cx26)基因突變分析及功能研究.pdf

1、目的：為明確湖南人群中非綜合征性耳聾患者發(fā)病的遺傳學基礎，分析了患者GJB2基因突變的情況，并探索其發(fā)病的分子機制。
　　 方法：經(jīng)過詳細的病史詢問和臨床檢查，收集了符合要求的、無親緣關系的非綜合征耳聾患者140例。PCR擴增患者GJB2基因的編碼序列全長，純化回收擴增產(chǎn)物，直接雙向測序，用DNAStar軟件分析測序結果，統(tǒng)計患者GJB2基因突變情況。選擇研究中發(fā)現(xiàn)的突變，設計引物擴增突變體全長，將其構建到pEGFP表達載體，經(jīng)

2、菌液PCR檢測、雙酶切鑒定并測序驗證之后，轉染Hela細胞，行Western blot檢測，熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察Cx26的表達情況，比較野生型與突變體之間亞細胞定位的差別；計數(shù)它們形成間隙連接通道的細胞數(shù)目，統(tǒng)計分析是否存在差異。
　　 結果：在140個無親緣關系的耳聾患者中，共有56例檢測到了Cx26基因突變，檢出率達40％(56/140)；其中29例患者兩個Cx26等位基因都發(fā)生突變，另27例患者只有一個Cx26等位

3、基因突變，等位基因突變率為30.4％(85/280)。一共發(fā)現(xiàn)了10種不同的堿基變異，包括7種致病突變和3種多態(tài)。7種致病突變分別是無義突變c.139G＞T；移碼突變c.176191de116和c.235delC；錯義突變c.109G＞A、c.344T＞G、c.550C＞T和c.571T＞C。c.344T＞G是一個新報道的錯義突變。最常見的突變是235delC，共有27個患者檢測到該突變，比例達19.3％(27/140)，其中純合突變2

4、0例，復合雜合突變2例，雜合突變5例，占所有致病性等位基因的55.3％（47/85等位基因）。109G＞A突變頻率僅次于235delC，有25個患者檢測到該突變，檢出率達17.9％(25/140)，其中純合突變7例，雜合突變18例，占所有致病性等位基因的37.6％（32/85等位基因）。選擇在患者中發(fā)現(xiàn)的突變，構建了Cx26wt及其突變體的真核表達載體：pEGFP-Cx26wt，pEGFP-Cx26V37I和pEGFP-Cx26F115