豬瘟病毒E0蛋白在酵母系統(tǒng)和哺乳動物細胞系統(tǒng)中的表達與鑒定.pdf

1、豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是一種高度接觸性傳染病，它由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起，具備很高的致死率。豬瘟病毒屬黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，自然感染后，機體可產(chǎn)生針對E2、E0和NS3蛋白的抗體。其中，E0是唯一可分泌到豬瘟病毒感染細胞培養(yǎng)液上清中的糖蛋白，另外，從分子學角度講，編碼E0的氨基酸序列要更為保守。因

2、此，在豬瘟的防治工程中，E0是主要的靶蛋白之一。目前對豬瘟病毒幾個主要的結構蛋白E0，E2和NS3研究較多，市面上的診斷試劑盒也多以E2蛋白為抗原。但是，E0蛋白的功能也同樣重要，它不但可以用來區(qū)別豬瘟病毒疫苗株和野毒株，而且能夠用來判斷機體是否曾經(jīng)感染過豬瘟病毒?，F(xiàn)階段比較成熟的表達E0蛋白的方法主要是原核表達和利用昆蟲細胞進行表達，這幾種方法不但使得蛋白的產(chǎn)量受到限制，而且所表達蛋白的生物學活性也較低。因此急需一種既能保障重組蛋白產(chǎn)

3、量又能保障其生物活性的表達E0蛋白的方法，從而為進一步研究E0蛋白的生物學功能奠定基礎。
　　本論文的主要內(nèi)容包括：
　　一：豬瘟病毒E0蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達與鑒定
　　巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種新型的外源蛋白表達系統(tǒng)，既具備了原核表達系統(tǒng)所具備的操作簡便、易于培養(yǎng)、生長快等優(yōu)點，還具備了原核表達系統(tǒng)所不具備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)ν庠吹鞍走M行糖基化、磷酸化、折疊、加工

4、和脂類?；４送?，畢赤酵母表達系統(tǒng)還具備其他表達系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)點，例如：含有目前啟動能力最強的AOX啟動子；糖基化程度低；表達過程中所分泌的自身蛋白極少，大大降低了蛋白純化的難度；既可以進行胞內(nèi)表達，也可以利用其特有的α-factor信號肽序列將所需蛋白分泌至培養(yǎng)基中；另外，在大規(guī)模培養(yǎng)方面，酵母具備很高的優(yōu)越性，適用于高密度發(fā)酵生產(chǎn)且生產(chǎn)過程成本低廉，外源蛋白的表達產(chǎn)量也很高。這些特點都使得該系統(tǒng)成為了目前為止應用最廣、研究最多的外

5、源蛋白表達系統(tǒng)之一。
　　本研究利用基因工程手段，成功構建能夠在畢赤酵母GS115菌株中表達E0蛋白的重組質(zhì)粒pPIC9K-E0，通過電轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化到GS115中，通過對誘導時間、誘導溫度以及甲醇的誘導濃度進行優(yōu)化，最終確定了28℃誘導溫度下甲醇終濃度為0.5％誘導120h可以使E0蛋白的產(chǎn)量達到最高。使用豬瘟病毒陽性血清對粗提后的E0蛋白進行Western blot鑒定和間接ELISA鑒定，鑒定結果表明，利用酵母菌株表達的重組E

6、0蛋白具備良好的反應原性，可以作為包被原對豬瘟病毒的E0抗體進行檢測。
　　二：豬瘟病毒E0蛋白在哺乳動物細胞中的表達與鑒定
　　長期以來，采用哺乳動物細胞來表達外源基因已經(jīng)被廣泛地應用于各種生物制品的研發(fā)過程，由于哺乳動物表達系統(tǒng)能夠促進蛋白的正確折疊和糖基化，因此，相對于其他兩種常見的表達系統(tǒng)——大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)，哺乳細胞表達系統(tǒng)所表達的蛋白與天然蛋白具有相似的理化性質(zhì)和生物學功能。常用的表達外源蛋白的哺乳

7、動物細胞表達系統(tǒng)有中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）、COS細胞、小倉鼠腎細胞（BHK細胞）、小鼠骨髓瘤 SP2/0細胞以及小鼠NSO胸腺瘤細胞等。在CSFV的培養(yǎng)過程中，利用同源性的豬腎、豬肺、豬脾或者骨髓等細胞的培養(yǎng)物非常有利于病毒的增殖，其中，較為常用的細胞系有SK6、PK-15以及CPK細胞系。
　　本研究利用基因工程手段，成功構建能夠在豬源性PK-15細胞中表達目的蛋白的重組質(zhì)粒PEGFP-E0，并通過化學轉(zhuǎn)染的方法將其插入