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文檔簡介
1、黃芩是我國傳統(tǒng)大宗中藥材,藥用價值高、臨床應用廣泛。近年,黃芩的相關制劑不斷開發(fā)和應用,黃芩苷原料藥需求不斷增加,而黃芩中藥材的產量和質量卻無明顯提高,這導致了黃芩供不應求的市場現(xiàn)狀。因此,探索一種行之有效的黃芩藥材及黃芩苷獲取方法已迫在眉睫!黃芩毛狀根培養(yǎng)及產物合成調控在生產周期、有效成分積累和農藥激素殘留等方面顯示出了獨特的優(yōu)勢。
本課題以黃芩毛狀根為試驗材料,在搖瓶液體培養(yǎng)工藝的基礎上,對其擴大培養(yǎng)工藝進行研究,并對
2、黃芩苷的提取純化方法進行優(yōu)化,建立了黃芩毛狀根的擴大培養(yǎng)工藝及其黃芩苷的提取純化方法。研究結果如下:
1.對不同類型培養(yǎng)器中黃芩毛狀根的生產和黃芩苷代謝情況進行研究,優(yōu)選其最適培養(yǎng)器類型,并進行設計改良。結果:
(1)在自制鼓泡式培養(yǎng)器(Φ170mm×450mm,10L)中,通氣量控制在10-40L·h-1時黃芩毛狀根生長良好,經40d培養(yǎng)后其生物量和黃芩苷含量分別為5.43g·L-1和4.86%;
3、 (2)以培養(yǎng)器中平均氣含率為指標,改良鼓泡培養(yǎng)器結構,其參數(shù)為每平方米橫截面氣孔數(shù)設置為700、氣孔直徑為0.5mm時,在整個培養(yǎng)周期內,通氣量控制在10-20L·h-1即可維持液體培養(yǎng)基中的溶氧值高于30%。
2.通過測定不同培養(yǎng)期黃芩毛狀根的生物量和黃芩苷含量、監(jiān)測培養(yǎng)周期內培養(yǎng)基成分消耗規(guī)律和培養(yǎng)條件變化趨勢,研究培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和條件與生物量積累及黃芩苷代謝合成的相關性,分析黃芩毛狀根在含60g·L-1蔗糖、0
4、.5g·L-1水解乳蛋白的改良MS液體培養(yǎng)基中,28±1.0℃、20L·h-1通氣量和避光條件下進行擴大培養(yǎng)的動力學特點。結果:
(1)黃芩毛狀根生物量的增長呈“S”型,生長速率則呈周期性變化,整個培養(yǎng)期可分為延滯萌發(fā)期、快速生長期、代謝合成期和合成后期四個階段,其在快速生長期生長速率最高達0.49g·d-1,在延滯萌發(fā)和代謝合成期則處于生長緩慢或停滯狀態(tài),生長速率接近零;
(2)碳源的消耗規(guī)律與搖瓶培養(yǎng)類似
5、,黃芩毛狀根的生長可利用果糖和葡萄糖,而代謝合成主要消耗果糖。但擴大培養(yǎng)時碳源的利用率明顯降低,培養(yǎng)結束時總糖濃度為41.5g·L-1,其消耗量約為搖瓶培養(yǎng)的50%,且蔗糖水解速率減緩;
(3)硝態(tài)氮的消耗與黃芩毛狀根的生長密切相關,在快速生長期(9-24d)其與生物量增長呈線性關系(Y=-0.0411X+4.4417,r=0.9742),到27d時培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量降至接種時的26.3%。但在黃芩苷的代謝合成過程中,硝態(tài)
6、氮無明顯消耗;
(4)在快速生長期(9-30d),磷的消耗與生物量消耗呈線性關系(Y=-0.3299X+5.2549,r=0.9840),到35d時培養(yǎng)基中的磷被耗盡;
(5)鉀的消耗與黃芩毛狀根生長有關,在9-27d鉀隨生物量的增加快速消耗,且具有線性關系(Y=-0.0207X+8.4178,r=0.9854);
(6)鐵在培養(yǎng)初期(0-6d)被少量消耗后一直穩(wěn)定在3.5mg·L-1左右,可能
7、只與黃芩毛狀根的萌發(fā)有關。
3.以生物量和黃芩苷含量為指標,考察黃芩毛狀根保藏、活化、復壯和接種的工藝條件,并優(yōu)化擴大培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件,以確定黃芩毛狀根擴大培養(yǎng)的工藝流程與關鍵控制點。結果:
(1)采用低糖濃度室溫法保藏黃芩毛狀根,最佳蔗糖濃度為2.0g·L-1,室溫保藏期限可達1.5年,且保藏成本和可操作性均優(yōu)于冷藏法;
(2)黃芩毛狀根活化工藝和條件為:采用搖瓶培養(yǎng),按5.0g·L-1接
8、種量在含50g·L-1葡萄糖的改良MS培養(yǎng)基中,28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)18d;
(3)黃芩毛狀根一級種子培養(yǎng)條件:采用250mL搖瓶培養(yǎng),按5.0g·L-1接種量在含0.2mmol·L-1苯丙氨酸、40g·L-1蔗糖和10g·L-1葡萄糖的改良MS培養(yǎng)基中,28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)20d;
(4)黃芩毛狀根二級種子培養(yǎng)條件:采用500mL搖瓶培養(yǎng),按10.
9、0g·L-1接種量在含0.2mmol·L-1苯丙氨酸、60g·L-1蔗糖的改良MS培養(yǎng)基中,28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)20d;
(5)溶氧為擴大培養(yǎng)時的關鍵因素,在培養(yǎng)周期內應調節(jié)通氣量使其不低于20%。通氣量調節(jié)控制點:0-9d為15L·h-1,10-30d為30-40L·h-1,31-50d為20L·h-1;
(6)培養(yǎng)基補加工藝和條件:培養(yǎng)基采用生產培養(yǎng)基Ⅱ,在培養(yǎng)至20d時,一
10、次性流加初始培養(yǎng)基體積的1/5;
(7)在建立的擴大培養(yǎng)工藝和條件下進行活化、復壯,接種至鼓泡式培養(yǎng)器培養(yǎng)50d,黃芩毛狀根生物量和黃芩苷含量分別達9.41g·L-1和11.76%。
4.以黃芩毛狀根為材料,利用大孔吸附樹脂和硅膠柱層析對黃芩苷進行提取和純化。結果:
(1)黃芩苷提取的上樣工藝和條件:以LX-22大孔吸附樹脂為分離介質,將濃度為8.69g·L-1上樣液,以相當于濕樹脂重量6BV·
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