黃芩毛狀根擴大培養(yǎng)工藝及黃芩苷純化的研究.pdf

1、黃芩是我國傳統(tǒng)大宗中藥材，藥用價值高、臨床應用廣泛。近年，黃芩的相關制劑不斷開發(fā)和應用，黃芩苷原料藥需求不斷增加，而黃芩中藥材的產量和質量卻無明顯提高，這導致了黃芩供不應求的市場現(xiàn)狀。因此，探索一種行之有效的黃芩藥材及黃芩苷獲取方法已迫在眉睫！黃芩毛狀根培養(yǎng)及產物合成調控在生產周期、有效成分積累和農藥激素殘留等方面顯示出了獨特的優(yōu)勢。
　　 本課題以黃芩毛狀根為試驗材料，在搖瓶液體培養(yǎng)工藝的基礎上，對其擴大培養(yǎng)工藝進行研究，并對

2、黃芩苷的提取純化方法進行優(yōu)化，建立了黃芩毛狀根的擴大培養(yǎng)工藝及其黃芩苷的提取純化方法。研究結果如下:
　　 1.對不同類型培養(yǎng)器中黃芩毛狀根的生產和黃芩苷代謝情況進行研究，優(yōu)選其最適培養(yǎng)器類型，并進行設計改良。結果:
　　 (1)在自制鼓泡式培養(yǎng)器(Φ170mm×450mm，10L)中，通氣量控制在10-40L·h-1時黃芩毛狀根生長良好，經40d培養(yǎng)后其生物量和黃芩苷含量分別為5.43g·L-1和4.86％;
　

3、　 (2)以培養(yǎng)器中平均氣含率為指標，改良鼓泡培養(yǎng)器結構，其參數(shù)為每平方米橫截面氣孔數(shù)設置為700、氣孔直徑為0.5mm時，在整個培養(yǎng)周期內，通氣量控制在10-20L·h-1即可維持液體培養(yǎng)基中的溶氧值高于30％。
　　 2.通過測定不同培養(yǎng)期黃芩毛狀根的生物量和黃芩苷含量、監(jiān)測培養(yǎng)周期內培養(yǎng)基成分消耗規(guī)律和培養(yǎng)條件變化趨勢，研究培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和條件與生物量積累及黃芩苷代謝合成的相關性，分析黃芩毛狀根在含60g·L-1蔗糖、0

4、.5g·L-1水解乳蛋白的改良MS液體培養(yǎng)基中，28±1.0℃、20L·h-1通氣量和避光條件下進行擴大培養(yǎng)的動力學特點。結果:
　　 (1)黃芩毛狀根生物量的增長呈“S”型，生長速率則呈周期性變化，整個培養(yǎng)期可分為延滯萌發(fā)期、快速生長期、代謝合成期和合成后期四個階段，其在快速生長期生長速率最高達0.49g·d-1，在延滯萌發(fā)和代謝合成期則處于生長緩慢或停滯狀態(tài)，生長速率接近零;
　　 (2)碳源的消耗規(guī)律與搖瓶培養(yǎng)類似

5、，黃芩毛狀根的生長可利用果糖和葡萄糖，而代謝合成主要消耗果糖。但擴大培養(yǎng)時碳源的利用率明顯降低，培養(yǎng)結束時總糖濃度為41.5g·L-1，其消耗量約為搖瓶培養(yǎng)的50％，且蔗糖水解速率減緩;
　　 (3)硝態(tài)氮的消耗與黃芩毛狀根的生長密切相關，在快速生長期(9-24d)其與生物量增長呈線性關系（Y=-0.0411X+4.4417，r=0.9742），到27d時培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量降至接種時的26.3％。但在黃芩苷的代謝合成過程中，硝態(tài)

6、氮無明顯消耗;
　　 (4)在快速生長期(9-30d)，磷的消耗與生物量消耗呈線性關系（Y=-0.3299X+5.2549，r=0.9840），到35d時培養(yǎng)基中的磷被耗盡;
　　 (5)鉀的消耗與黃芩毛狀根生長有關，在9-27d鉀隨生物量的增加快速消耗，且具有線性關系（Y=-0.0207X+8.4178，r=0.9854）;
　　 (6)鐵在培養(yǎng)初期（0-6d）被少量消耗后一直穩(wěn)定在3.5mg·L-1左右，可能

7、只與黃芩毛狀根的萌發(fā)有關。
　　 3.以生物量和黃芩苷含量為指標，考察黃芩毛狀根保藏、活化、復壯和接種的工藝條件，并優(yōu)化擴大培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以確定黃芩毛狀根擴大培養(yǎng)的工藝流程與關鍵控制點。結果:
　　 (1)采用低糖濃度室溫法保藏黃芩毛狀根，最佳蔗糖濃度為2.0g·L-1，室溫保藏期限可達1.5年，且保藏成本和可操作性均優(yōu)于冷藏法;
　　 (2)黃芩毛狀根活化工藝和條件為:采用搖瓶培養(yǎng)，按5.0g·L-1接

8、種量在含50g·L-1葡萄糖的改良MS培養(yǎng)基中，28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)18d;
　　 (3)黃芩毛狀根一級種子培養(yǎng)條件:采用250mL搖瓶培養(yǎng)，按5.0g·L-1接種量在含0.2mmol·L-1苯丙氨酸、40g·L-1蔗糖和10g·L-1葡萄糖的改良MS培養(yǎng)基中，28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)20d;
　　 (4)黃芩毛狀根二級種子培養(yǎng)條件:采用500mL搖瓶培養(yǎng)，按10.

9、0g·L-1接種量在含0.2mmol·L-1苯丙氨酸、60g·L-1蔗糖的改良MS培養(yǎng)基中，28±1.0℃、搖床110r·min-1下避光培養(yǎng)20d;
　　 (5)溶氧為擴大培養(yǎng)時的關鍵因素，在培養(yǎng)周期內應調節(jié)通氣量使其不低于20％。通氣量調節(jié)控制點:0-9d為15L·h-1，10-30d為30-40L·h-1，31-50d為20L·h-1;
　　 (6)培養(yǎng)基補加工藝和條件:培養(yǎng)基采用生產培養(yǎng)基Ⅱ，在培養(yǎng)至20d時，一

10、次性流加初始培養(yǎng)基體積的1/5;
　　 (7)在建立的擴大培養(yǎng)工藝和條件下進行活化、復壯，接種至鼓泡式培養(yǎng)器培養(yǎng)50d，黃芩毛狀根生物量和黃芩苷含量分別達9.41g·L-1和11.76％。
　　 4.以黃芩毛狀根為材料，利用大孔吸附樹脂和硅膠柱層析對黃芩苷進行提取和純化。結果:
　　 (1)黃芩苷提取的上樣工藝和條件:以LX-22大孔吸附樹脂為分離介質，將濃度為8.69g·L-1上樣液，以相當于濕樹脂重量6BV·