齊墩果酸對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:建立外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)以及細(xì)胞因子活化的T細(xì)胞培養(yǎng)體系,初步探討經(jīng)齊墩果酸(oleanolic acid,OA)處理的DC對(duì)活化T細(xì)胞的影響。體外檢測(cè)經(jīng)不同濃度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)齊墩果酸處理后的DC細(xì)胞膜表面標(biāo)志、形態(tài)以及細(xì)胞因子分泌的異同。
  方法:取健康成人外周血,分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood

2、mononuclear cells,PBMC),用細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)培養(yǎng)并獲得DC;以細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素1α(IL-1α)、干擾素-γ(IFN-γ)以及CD3單克隆抗體(CD3McAb)刺激制備活化T細(xì)胞;在DC細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)添加不同濃度的OA,分別記為OA-DC-I組(25μg/ml)、OA-DC-II組(50μ

3、g/ml)、OA-DC-III組(100μg/ml)、OA-DC-IV組(200μg/ml)。培養(yǎng)至7天用流式細(xì)胞學(xué)檢查DC細(xì)胞膜標(biāo)志;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法(enzyme-linked immunospot assay.ELISPOT)檢測(cè)DC對(duì)活化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響。
  結(jié)果:
  1. DC形態(tài)及表型分析,比較OA對(duì)DC表型的影響:
  DC形態(tài)觀察:從健康成人外周血分離單核細(xì)胞,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí),貼壁

4、細(xì)胞用于誘導(dǎo)生成DC。培養(yǎng)至第7天倒置顯微鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞變大,不規(guī)則,伸出偽足,呈典型樹(shù)突狀細(xì)胞。
  DC表型分析:流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC以及OA-DC表面分子表達(dá)情況。培養(yǎng)第7天DC細(xì)胞表面分子CD86/CD80、CD83和HLA-DR表達(dá)分別為:DC組1355.88±2880.12,92.21±18.19和1034+279.18; OA-DC-Ⅰ組1298.54±198.87,91.22±18.70和1166.76+267.7

5、8; OA-DC-Ⅱ組1143.77±201.32,90.09±17.65和1105.54+251.78;OA-DC-Ⅲ組897.54±197.45,68.11±18.20和503.57+98.02; OA-DC-Ⅳ組564.33±187.69,8.89±2.21和21.37+2.02。與 DC細(xì)胞比較,OA可以顯著降低CD86+/CD80+表達(dá)(P<0.05)。HLA-DR+和CD83的表達(dá)在DC、OA-DC I組和II組之間比較無(wú)顯

6、著性差異(P>0.05),但隨著OA濃度的增加,其表達(dá)量顯著降低,DC細(xì)胞、OA-DC III組和IV組有極顯著差異(p<0.01),這說(shuō)明OA可以抑制DC成熟。
  2. ELISPOT法檢測(cè)OA處理后的DC對(duì)活化T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響:
  計(jì)數(shù)并調(diào)整好細(xì)胞濃度,在已包被好的ELISPOT板中分別加入經(jīng)不同濃度OA處理的DC與活化T細(xì)胞共培養(yǎng),ELISPOT READER定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IFN-γ分泌量隨著OA濃度的增

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