α-突觸核蛋白和氧化應激在PC12細胞中關系研究.pdf

1、背景：帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是一種常見的中老年神經系統退變性疾病，平均發(fā)病年齡為55 歲，70歲人群發(fā)病率達120/1萬。PD的確切發(fā)病機制尚不清楚，目前研究顯示其主要病理標志為選擇性黑質多巴胺(DA)神經元缺失，殘存神經元呈現a-突觸核蛋白(α-synucelin, AS)和泛素染色陽性的胞漿內包涵體( Lewy Body, LB)形成,黑質-紋狀體通路DA 釋放減少，患者出現靜止性震顫，肌張力增

2、高，運動減少、隨意運動缺失、木僵等一系列癥狀。Α-突觸核蛋白（α-synuclein, SNCA）是第一個被發(fā)現的PD 致病基因。Synuclein 是分布于腦內突觸前末梢的一組蛋白，被命名為α-synuclein,β-synuclein 和γ-synuclein。它們由113-143 個氨基酸殘基組成，參與DA 的神經傳遞過程和突觸內囊泡的轉運功能。在這些蛋白中，α-synuclein 與PD 的發(fā)病有關。從幾個PD 大家系的研究中發(fā)

3、現，患者的染色體臂的4q21-23 攜有α-synuclein 突變位點，并呈染色體顯性遺傳。神經變性疾病的病因、臨床表現各不相同，但都具有隨年齡增長（中年以后）逐漸發(fā)生并進展的特征。神經變性疾病的發(fā)病機制中，毒性蛋白的錯誤折疊和異常聚集是其中的關鍵環(huán)節(jié)如α-synuclein,SNCA 基因突變（A53T）更容易形成聚集，導致家族性早發(fā)PD。研究顯示，SNCA 突變或過度表達可加速線粒體功能障礙、增強對氧化應激的敏感性以及DAT 介導

4、的毒性促進細胞死亡。Α-synuclein 是Lewy 小體形成的聚集蛋白。Lewy 小體不僅存在于PD 患者腦內，還存在于多種神經退行性病的神經組織中。
　　 目的：開展對α-synuclein 所介導Lewy 小體病的病理機制研究，以及氧化應激與α-synuclein 之間的關系，對認識和診斷這類疾病具有重要的意義。
　　 方法：①構建及鑒定人野生型及突變型SNCA 基因慢病毒表達載體，并觀察在體外大鼠嗜鉻細胞瘤細胞

5、中的表達。在引物合成后采用PCR 技術擴增目的基因，并將基因克隆到慢病毒載體表達質粒pGC-FU(含 GFP 基因)中，構建慢病毒載體表達質粒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP，通過酶切、測序驗證后，將pGC-FU-SNCA-GFP、pGC-FU-SNCAmu-GFP 質粒和包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0 共同轉染大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12 細胞， 并獲得穩(wěn)定轉染。通過噻唑蘭比色法（

6、 MTT 法） 檢測穩(wěn)定轉染后細胞凋亡水平， 慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP(OE)和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實驗組)(Oem)及不加病毒的空白對照組（CON）和pGC-FU-GFP 空載體對照組（NC）共四組細胞, 病毒轉染后不同時間（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）細胞增殖情況；碘化丙錠單染法（PI 單染法）檢測細胞周期，CON 組、NC 組、OE 組和Oem 組共四組細胞，檢測G1 期、G2 期和M期細胞

7、百分比。②利用已建立好的OE 型和Oem 型細胞，測定未轉染、轉染空質粒、野生型（WT）及突變型（A53T）α-synuclein 的PC12 細胞的活性氧（ROS）水平，以實時定量PCR 法和Western blot 法檢測分析經0、50、100 和250 nmol/LH2O2 處理的OE 型和Oem 型細胞α-synuclein 表達。以細胞免疫熒光法和Westernblot 法檢測分析經0、50、100 和250 nmol/L H

8、2O2處理的OE 型和Oem 型細胞Lamp-2和LC-3 蛋白的表達。
　　 結果：⑴通過檢測標簽蛋白綠色熒光蛋白(GFP)和目的蛋白，進一步驗證pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCA-GFP 在靶細胞中的表達。通過MTT 法檢測穩(wěn)定轉染后細胞凋亡水平，慢病毒pGC-FU-SNCA-GFP 和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實驗組)及不加病毒的空白對照組和pGC-FU-GFP 空載體對照組共四組細胞,

9、病毒轉染后不同時間（1d, 2d, 3d, 4d, 5d）細胞增殖F 值和P 值分別為4.534 和0.02；196.285 和0.00；411.829 和0.00；1282.049 和0.00；3135.559 和0.00，細胞增殖變緩。PI 單染法檢測細胞周期，與空載體組相比，pGC-FU-SNCA-GFP 組和pGC-FU-SNCAmu-GFP (實驗組)組G1 期細胞百分比均增多（P=0.00；P=0.00），pGC-FU-SN

10、CAmu-GFP 組較pGC-FU-SNCA-GFP 組G1 期細胞百分比增多更明顯（P=0.00）。⑵α-synuclein 轉染PC12 細胞后，細胞內ROS 水平增加，按未轉染的PC12 細胞、轉染空質粒的PC12 細胞、WT 型PC12 細胞、A53T 型 PC12細胞順序ROS 水平依次增加（P<0.05）；經不同濃度H2O2 處理后，OE 型和Oem 型細胞α-synuclein mRNA 表達水平均無明顯改變，OE 型細胞

11、不同濃度組之間無統計學差異（P> 0.05），Oem 型細胞不同濃度組之間無統計學差異（P> 0.05）；在Western blot 檢測中，隨著H2O2 濃度增加，α-synuclein 表達在OE 型細胞中減少，在Oem 型細胞中增加（均P<0.05）。H2O2處理后，LC3 蛋白的表達在OE型細胞中表達減少，但在Oem 型細胞中表達增強；在Oem 型細胞中，Lamp-2 蛋白的表達在H2O2 處理后減少，而在OE 型細胞表達增加。