環(huán)孢素A動脈灌注局部免疫抑制在大鼠異體后肢移植中的應用.pdf

1、第一部分大鼠股動脈灌注局部免疫抑制模型的建立
　　 背景：
　　 高血藥濃度伴隨的毒副作用是困擾移植研究的難題，而移植物組織內的藥物濃度又是延長其存活的關鍵因素。腫瘤學的經(jīng)驗證明，局部用藥是降低全身血藥濃度、提高靶向組織藥物利用率的一條可行出路。多種免疫抑制劑已被證明可通過動脈直接灌注的方式成倍提高移植物內的藥物濃度。但既往研究所用藥物老舊，且由于缺乏有效的藥物緩釋工具，無法對免疫抑制劑的長期動脈灌注進行跟蹤觀察。隨著環(huán)

2、孢素等強效免疫抑制劑的廣泛應用，以及各種新型藥物緩釋工具的推廣，使得動脈內長期藥物灌注成為可能。
　　 目的;
　　 通過構建大鼠肢體再植模型，模擬異體移植的血運狀態(tài)，分析環(huán)孢素A動脈灌注的藥物動力學特點，探討局部動脈灌注長期免疫抑制的可行性。
　　 方法:
　　 1.實驗動物分組
　　 SPF級成年雄性SD大鼠60只，體重300～350g。大鼠隨機等分為“口服灌胃組”、“腹腔注射組”、“靜脈灌注

3、組”和“動脈灌注組”。每組分別下設3個亞組，每亞組5只，分別對應2.5mg·kg-1·day-1、5.0mg·kg-1·day-1、10mg·kg-1·day-1三種不同等級的環(huán)孢素給藥劑量。
　　 2.肢體再植模型
　　 所有受試大鼠于右后肢橫行截肢后原位再植，于右股骨中段離斷所有血管神經(jīng)束和大腿肌群，鋸斷股骨。隨后以18G不銹鋼針頭對股骨行原位髓內固定。以標準顯微外科技術吻合股動靜脈和坐骨神經(jīng)。絲線間斷縫合肌肉和皮膚

4、
　　 3.環(huán)孢素A干預
　　 所有實驗動物給予環(huán)孢素A持續(xù)免疫抑制60天?？诜辔附M和腹腔注射組每日予環(huán)孢素間斷給藥一次。靜脈灌注組和動脈灌注組大鼠背部皮下埋置灌注專用Smith受藥接頭，并行再植肢體（右側）股動靜脈插管，以微量泵每日持續(xù)灌注等量藥物。各亞組分別給予環(huán)孢素2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1。血管內藥物投放采用“環(huán)孢素保存液+低分子右旋糖酐抗凝稀釋液”的分段式雙通道預混合灌注模式，避免藥物曠置

5、分解及血栓等并發(fā)癥。
　　 4.環(huán)孢素血藥濃度檢測
　　 觀察到期后采集大鼠胸主動脈全血樣本，以酶放大免疫法測定外周血環(huán)孢素藥物濃度，比較不同給藥途徑所得的全身血藥濃度，及不同給藥方式的血藥濃度的轉化率。
　　 5.再植肢體環(huán)孢素組織濃度檢測
　　 60天末取再植肢體皮膚與肌肉標本，經(jīng)組織碎化處理后制備勻漿液，以酶放大免疫法測定組織內環(huán)孢素藥物濃度。分析動脈灌注環(huán)孢素的局部藥物濃度優(yōu)勢。
　　 6

6、.統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，經(jīng)SPSS13.0軟件采用單向方差分析（ANOVA）和析因方差分析進行統(tǒng)計處理，比較不同給藥途徑對環(huán)孢素全身血藥濃度的影響，分析不同給藥途徑對于提高組織內藥物濃度的效率。
　　 結果:
　　 1.大體觀察
　　 腹腔注射組有40％（5例中的2例）大鼠因長期反復注射出現(xiàn)腹腔感染，靜脈灌注組中有2例懷疑死于高濃度環(huán)孢素蓄積導致的藥物毒性?？诜辔附M和動脈灌注

7、組大鼠耐受良好。動脈灌注組未發(fā)生感染、血栓等并發(fā)癥。
　　 2.血藥濃度比較
　　 動脈直接灌注環(huán)孢素使得血藥濃度較靜脈用藥降低28％～40％（P＜0.05）。給予低劑量(2.5mg·kg-1·day-1)環(huán)孢素時，動脈灌注組血藥濃度略高于口服組和腹腔注射組。灌注“中等～高”劑量(5～10mg·kg-1·day-1)環(huán)孢素時，所得全身血藥濃度與口服和腹腔注射相當?？诜h(huán)孢素A的生物學轉化率約為23％～52％，隨劑量增大吸

8、收率逐漸提高，顯示胃腸道對環(huán)孢素的首關消除作用有飽和現(xiàn)象。腹腔注射環(huán)孢素轉化率為43％～69％，中等劑量下（5mg·kg-1·day-1）利用率最高。動脈灌注環(huán)孢素利用率較為恒定，為60％～72％。
　　 3.再植肢體組織內環(huán)孢素濃度比較
　　 動脈灌注組皮膚組織環(huán)孢素濃度為等劑量口服組的4.6～25.9倍，腹腔組的4.1～14.5倍，靜脈組2.4～5.1倍。肌肉內藥物濃度分別為等劑量口服組3.2～12倍，腹腔組3.3～

9、7.9倍，靜脈組的1.7～3.3倍。
　　 結論:
　　 局部動脈灌注環(huán)孢素與全身用藥相比，能有效降低全身血藥濃度，成倍提高目標組織內的藥物在濃度。單一肢體的長期動脈灌注模型穩(wěn)定可靠。
　　 第二部分環(huán)孢素A局部動脈灌注在大鼠肢體移植中的應用
　　 背景:
　　 已有多種藥物被證明可通過局部動脈灌注促進移植物的存活。但既往研究所用藥物因效能不佳均已淘汰。環(huán)孢素臨床應用成熟，且已被已被證明可通過局部

10、外用發(fā)揮免疫抑制作用。藥物動力學研究顯示環(huán)孢素動脈直接灌注可進一步提高其在移植物中的分布，但其實際抗排斥效果，尤其是長期灌注的效能尚未得到驗證。
　　 目的:
　　 通過構建大鼠后肢異體移植模型，研究動脈直接灌注環(huán)孢素A對移植物存活的影響，探討動脈灌注局部免疫抑制的可行性，分析長期動脈灌注下環(huán)孢素在內臟的蓄積作用，為局部免疫抑制的臨床應用積累理論基礎。
　　 方法:
　　 1.大鼠異體后肢移植模型構建

11、r>　　 通過標準顯微血管外科技術構建異種大鼠后肢再植模型。選取近交系棕色BrownNorway大鼠(BN;RT1n)和白色Lewis大鼠(LEW;RT11)分別作為后肢的供體和受體。受體大鼠術前一天給予兔抗大鼠淋巴細胞血清1.0ml+環(huán)孢素10mg·kg-1·day-1腹腔注射一次進行免疫誘導。于供體BN大鼠右股骨中段橫行截肢，離斷所有股血管神經(jīng)束及股骨。受體LEW大鼠同等平面截肢，以顯微血管外科技術“端—端”吻合供受體股動靜脈和坐

12、骨神經(jīng)。股骨斷端以18G髓內釘固定。肌肉、皮膚行間斷縫合。另取Lew大鼠以同法截肢后原位再植作為同系移植對照。
　　 2.實驗動物分組
　　 受體Lewis大鼠5只接受自體后肢再植作為同系移植對照組(Iso)。單純異體移植組(Allo)5只，僅行異體后肢移植而不接受免疫抑制療程，作為對照。另選異體移植大鼠（54只）接受環(huán)孢素A持續(xù)免疫抑制，并按給藥途徑隨機分成腹腔注射組(I.P.)、靜脈灌注組(I.V.)和動脈灌注組(I

13、.A.)。各組下設3個亞組，分別給予2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1三種劑量的環(huán)孢素。腹腔注射組每日予腹腔藥物注射一次，動脈灌注組和靜脈灌注組行股動靜脈置管，每日予等量藥物以微量泵行連續(xù)血管內灌注。
　　 3.長期灌注模型的實現(xiàn)
　　 動脈和靜脈灌注組大鼠接受肢體移植后，采用“體內段+體外段”的分段式灌注管路，構建長期血管灌注通道。體內段包含大鼠背部皮下埋置專用受藥接頭泵，連接聚氨酯抗凝導管植入大鼠移植肢體

14、股動靜脈。體外段管路以微量泵經(jīng)特殊皮外接頭注入皮下受藥接頭，與體內段實現(xiàn)連接。體內段長期封閉于皮下，避免長期留置引起的感染。體外段便于拆卸、更換及定期消毒。免疫抑制劑藥液采用“環(huán)孢素保存液+肝素化低分子右旋糖抗凝稀釋液”雙通道預混合方式輸注。藥物以原液形式保存，與稀釋液在三通管內即時混合后注入血管，避免藥液長期曠置引起的分解及毒性增高。抗凝稀釋液采用臨床封管液材料，最大限度降低導管血栓機率。
　　 4.生存期觀察
　　

15、每日記錄移植物存活情況，出現(xiàn)不可逆性嚴重排斥反應（臨床評分3級以上）或肢體存活超過100天作為觀察終點。對比不同給藥途徑和不同環(huán)孢素劑量下移植物的存活期差異。
　　 5.移植物組織學比較
　　 觀察中止后對移植物行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。行蘇木精—依紅染色，并行組織病理學觀察，比較不同給藥途徑下的排斥反應特點。
　　 6.移植物排斥度病理評分對肢體長期存活的個體，取移植物前、后、內、外四處皮膚組織，按Banff

16、2007復合組織移植物病理評分，計算移植物平均排斥度。比較不同給藥途徑對移植物排斥程度的影響。
　　 7.內臟藥物蓄積比較
　　 對移植物長期存活的大鼠，切取其肝臟和右側腎臟，經(jīng)碎化處理后制備組織勻漿，以酶放大免疫法檢測組織內環(huán)孢素藥物濃度，評價長期灌注后內臟藥物蓄積情況。
　　 8.統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0軟件采用單向方差分析(ANOVA)和析因方差分析進行統(tǒng)計處理，排斥度等級資料采

17、用非參數(shù)秩和檢驗。
　　 結果:
　　 1.大體觀察
　　 自體再植對照組大鼠無任何排斥跡象。單純移植組大鼠無一例外出現(xiàn)嚴重排斥反應，移植物出現(xiàn)進行性紅斑、皮疹、脫毛、肢體腫脹，直至最終肢體壞死脫落。各環(huán)孢索干預組中未達長期存活個體，最終肢體反應與單純移植組類似。環(huán)孢素劑量為2.5mg·kg-1·day-1時，動脈灌注組以肢體腫脹為主的體液免疫表現(xiàn)較為明顯，而局部皮膚損害較全身用藥組略輕。大劑量環(huán)孢素治療時，腹腔

18、注射組2例出現(xiàn)反復注射引起的腹腔感染。靜脈組部分大鼠出現(xiàn)活動減少、精神差等藥物毒性反應。其中兩例大鼠懷疑因不耐受大劑量藥物的長期蓄積而死亡。腹腔注射組和靜脈灌注組毛發(fā)再生緩慢或再生不全，肢體反復出現(xiàn)紅斑、腫脹等慢性排斥反應直至最后瘢痕形成。動脈灌注組大鼠無明顯不良反應，僅有2例大鼠出現(xiàn)術后移植物傷口愈合稍遲?？紤]與皮膚組織環(huán)孢素濃度高，抑制組織活力有關。
　　 2.生存期觀察
　　 所有經(jīng)環(huán)孢素干預大鼠的移植物存活期均較

19、單純異體移植組延長，顯示環(huán)孢素應用有利于移植物存活。單純動脈灌注小劑量環(huán)孢素(2.5mg·kg-1·day-1)無法實現(xiàn)移植物長期存活，但平均存活天數(shù)為39.4±9.1天，顯著高于等劑量靜脈灌注組（21.0±3.9，P＜0.05）和腹腔注射組（13.6±1.9天，P＜0.01）。給予中等劑量環(huán)孢素(5.0mg·kg-1·day-1)時，僅動脈灌注組大鼠肢體長期存活（＞100天），顯著優(yōu)于腹腔注射組的46.4±7.0天和靜脈灌注組的56.

20、4±7.0天。大劑量(10mg·kg-1·day-1)時，三種給藥途徑大鼠移植物均能實現(xiàn)移植物長期存活，肢體存活期無統(tǒng)計學差異。
　　 3.組織學觀察
　　 單純移植組表現(xiàn)為典型的排斥反應，皮膚溶解壞死，移植物大量單核細胞浸潤。小劑量環(huán)孢素治療下，三種給藥途徑的病理學表現(xiàn)與單純移植組類似，動脈灌注組集中表現(xiàn)為血管周圍炎癥，皮膚與結締組織淋巴細胞浸潤較輕。中等～大劑量環(huán)孢素治療時，腹腔注射組和靜脈灌注組大鼠移植物中仍可見不

21、同程度排斥反應。動脈組僅有極少單核細胞浸潤或輕微血管周圍炎癥，部分大鼠移植物完全無排斥反應表現(xiàn)。
　　 4.評價排斥度比較
　　 長期存活移植物組織學評分顯示，動脈灌注組平均排斥度顯著小于等劑量腹腔注射組和靜脈灌注組（P＜0.01）。
　　 5.長期灌注內臟藥物蓄積比較
　　 經(jīng)動脈灌注后，肝臟藥物環(huán)孢素濃度較腹腔注射和靜脈用藥分別下降了19％和35％（P＜0.01）。腎臟組織CSA濃度較靜脈組下降31％

22、，與腹腔組相比無顯著性差異。
　　 結論:
　　 各種給藥途徑應用環(huán)孢素均可促進移植物存活。尤以動脈直接灌注更能延長移植物存活時間，降低排斥反應程度，長期應用可以減少肝腎藥物蓄積。環(huán)孢素單一藥物全身性給藥，即便采用大劑量仍無法戒絕復合組織移植的排斥反應。動脈灌注中等劑量環(huán)孢素即可實現(xiàn)免疫耐受，完全抑制排斥現(xiàn)象。單純小劑量環(huán)孢素即便采用局部動脈灌注仍不能避免排斥反應。維持一定水平的全身血藥濃度有助于控制體液免疫水平，對于促