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文檔簡介
1、目的: 構(gòu)建重組瘦素基因(Leptin)真核表達(dá)質(zhì)粒pTraceTM-Leptin;轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cell,MSCs),研究Leptin基因?qū)SCs增殖分化的影響。 方法: 提取人脂肪組織總RNA,根據(jù)GeneBank公布的Leptin基因序列設(shè)計合成一對引物,采用RT-PCR技術(shù)克隆Leptin基因,酶切后重組到帶有GFP標(biāo)記的pTracerTM-CMV/Bsd載體上
2、,構(gòu)建重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin。采用密度梯度離心法體外獲得SD大鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,將重組真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞,以抗生素Blasticidin加壓篩選獲得Leptin基因修飾的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài),采用分子生物學(xué)法(RT-PCR法)和免疫學(xué)法(Western blot法)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測目的基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的轉(zhuǎn)
3、錄和翻譯,MTT法檢測Leptin基因?qū)SCs的生長增殖情況,ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清骨鈣素(OC)分泌水平,并采用對硝基苯磷酸鹽(PNP)試劑盒測定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活力,半定量RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Cbfαl和Cbfβ的表達(dá)。 結(jié)果: 成功獲得約450bp的人Leptin基因,PCR、雙酶切及序列測定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin,并
4、轉(zhuǎn)染密度梯度分離法獲得的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞,加壓篩選后獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,并伴有細(xì)胞形態(tài)變化,實驗組的RT-PCR和Western blot結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶,表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的Leptin基因可以在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),且促進(jìn)MSCs增殖,并有一定的時間依賴性,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清中OC含量增加,ALP活力上調(diào),成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfαl和Cbfβ mRNA表達(dá)量也增高。 結(jié)論: 本實驗成功構(gòu)建了重
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