放射線誘導自殺基因在鼻咽癌的靶向表達研究.pdf

1、目的：通過克隆人Egr-l啟動子，構建由Egr-l啟動子調(diào)控，含Egr-1-CD基因的重組真核表達載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD并轉染鼻咽癌細胞系(C№)，達到放射線誘導CD／5-Fc自殺基因系統(tǒng)在鼻咽癌細胞中靶向表達，觀察基因表達與放射的劑量效應關系，建立腫瘤基因——放射治療系統(tǒng)，通過放射線和基因的雙重作用殺傷腫瘤，提高放射增敏比，降低放療劑量，減少正常組織損傷。 方法：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫提供的人Egr-l啟

2、動子基因核苷酸序列，設計并合成一對引物，采用PCR方法，從人肝組織DNA中擴增出Egr-l基因片斷，與pcDNA3．1(+)一CD定向連接，構建受控于Egr-1啟動子的pcDNA3．1(+)一CD真核表達載體pcDN^3．1(+)Egr-1-CD，用限制性內(nèi)切酶，PCR擴增和DNA測序的方法鑒定真核表達載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD構建成功，并利用脂質體轉染的方法轉染人鼻咽癌細胞株，經(jīng)G418篩選后獲得表達陽性細胞克隆，RT

3、-PCR分析鑒定轉染成功。用不同劑量的X線照射表達陽性的鼻咽癌細胞，觀察基因表達與放射的劑量效應關系，進一步體外分組觀察不同的放射線誘導CD／5-Fc自殺基因系統(tǒng)對鼻咽癌細胞的殺傷效應，gFr方法檢測細胞存活比率，通過繪制不同組鼻咽癌細胞存活曲線，觀察放射增敏作用。 結果：成功克隆了人Egr-l啟動子，構建了真核表達載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶，PCR和DNA測序證實了其正確性，CD基因轉染CNE

4、細胞后，經(jīng)G418篩選后獲得陽性克隆株Egr-1-CD—CNE，經(jīng)RT-PCR分析CD基因已轉入CNE細胞并開始轉錄。電離輻射可誘導增強自殺基因陽性細胞株中CD基因的表達，電離輻射與前藥5-Fc的聯(lián)合應用大大增強了對自殺基因陽性CNE細胞的殺傷作用，其殺傷作用大于單獨自殺基因前藥系統(tǒng)和單獨照射。 結論：真核表達載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD構建及轉染CNE細胞成功，建立了基因表達與放射的劑量效應關系，放射線誘導Egr