microRNA-144在膽管癌中的表達(dá)及功能機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 膽管癌中microRNA差異的篩選和驗(yàn)證
　　目的：在膽管癌腫瘤組織及其癌旁膽管組織中篩選microRNAs的差異表達(dá)，為下一步的研究選擇研究對(duì)象。
　　方法：采用MicroArray表達(dá)譜芯片檢測(cè)3對(duì)膽管癌及癌旁膽管組織中miRNA的表達(dá)差異；根據(jù)芯片的結(jié)果進(jìn)行GO功能分析和Pathyway通路分析，對(duì)膽管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有關(guān)的miRNAs及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)實(shí)

2、時(shí)定量PCR在膽管癌組織和膽管癌細(xì)胞系中，對(duì)部分miRNA的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：同癌旁膽管組織相比較，膽管癌組織中一共有28條miRNA存在表達(dá)差異，其中19條上調(diào)，9條下調(diào)；GO分析和Pathyway分析顯示miR-144在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用；miR-144在膽管癌組織和膽管癌細(xì)胞系中均表達(dá)降低，與芯片檢測(cè)的結(jié)果相符合。
　　結(jié)論：膽管癌組織和癌旁膽管組織中miRNAs的表達(dá)存在明顯差異。在膽管

3、癌組織和膽管癌細(xì)胞系中miR-144的表達(dá)均降低，可以作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　第二部分 miR-144對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響
　　目的：體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-144對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響；初步探討其可能作用的下游蛋白。
　　方法：利用慢病毒載體PCDH-miR-144轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞系，構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-144的膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810和CCLP1；通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-144

4、對(duì)膽管癌細(xì)胞的增殖的影響；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Western Blot檢測(cè)miR-144對(duì)增殖、侵襲相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：過(guò)表達(dá)miR-144膽管癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功；miR-144顯著降低膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810、CCLP1細(xì)胞增殖的能力；miR-144明顯降低膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；miR-144降低p-AKT和MMP-2的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：在體外miR-14

5、4可以降低膽管癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)減低膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；miR-144對(duì)膽管癌增殖、遷移能力的影響可能是通過(guò)下調(diào)p-AKT和MMP-2表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分 miR-144作用靶點(diǎn)的篩選及驗(yàn)證
　　目的：篩選并驗(yàn)證miR-144的可能作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明miR-144的生物學(xué)功能。
　　方法：通過(guò)miRanda、PicTar和Target Scan軟件預(yù)測(cè)并驗(yàn)證可能的靶基因；構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因，驗(yàn)

6、證miR-144與靶基因的直接結(jié)合，并明確其結(jié)合位點(diǎn)；利用siRNA干擾沉默LIS1后檢測(cè)LIS1對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，Western Blot驗(yàn)證LIS1對(duì)增殖和侵襲相關(guān)的信號(hào)通路的影響，驗(yàn)證miR-144與LIS1功能學(xué)上的一致性。
　　結(jié)果：LIS1是miR-144可能的靶基因之一；miR-144可以通過(guò)結(jié)合于LIS1的3’UTR兩個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控LIS1的表達(dá)；干擾 LIS1后可以下調(diào)p-AKT和MM

7、P2的水平，從而影響膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲；
　　結(jié)論：miR-144通過(guò)直接作用于LIS1影響膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這種作用是通過(guò)下調(diào)p-AKT和MMP2來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第四部分 miR-144功能的體內(nèi)驗(yàn)證及其臨床意義
　　目的：體內(nèi)驗(yàn)證miR-144對(duì)膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用；在膽管癌臨床樣本中分析miR-144與臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，評(píng)估m(xù)iR-144的臨床價(jià)值。
　　方法：裸鼠皮下移植瘤和膽管

8、癌肝臟轉(zhuǎn)移模型分析miR-144對(duì)膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響；收集2008年3月至2012年9月同濟(jì)醫(yī)院住院手術(shù)的53例膽管癌病人的病理資料，RT-PCR檢測(cè)miR-144和LIS1的表達(dá)，分析二者的相關(guān)性；免疫組化檢測(cè)臨床樣本中LIS1、AKT、p-AKT、MMP2的表達(dá)；分析miR-144與臨床病理之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：miR-144也可以抑制裸鼠膽管癌移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；臨床樣本中miR-144與LIS1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；m