PEDF對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50的體外作用研究.pdf

1、本研究擬用本中心建立的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SO-Rb50研究PEDF對(duì)Rb的作用：包括：1)PEDF對(duì)SO-Rb50是否也有誘導(dǎo)分化的作用2)PEDF對(duì)SO-Rb50是否具有直接抑制和促凋亡的作用3)PEDF是否能下調(diào)SO-Rb50血管增生因子一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)。從而從體外水平證實(shí)PEDF對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療價(jià)值，為RB保守治療提供一種新的思路。 一、研究目的 通過(guò)從體外水平觀察PEDF對(duì)SO-Rb50分

2、化、增殖、凋亡及VEGF表達(dá)的的作用初步了解PEDF治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在價(jià)值，為Rb保守治療提供一種新的安全有效的途徑。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、通過(guò)倒置顯微鏡和免疫組化方法觀察50ng/ml PEDF對(duì)SO-Rb50細(xì)胞分化的作用，從形態(tài)學(xué)和免疫標(biāo)志方面來(lái)鑒定PEDF對(duì)其誘導(dǎo)分化作用。 2、通過(guò)MTT法來(lái)檢測(cè)PEDF對(duì)SO-Rb50增殖的影響，設(shè)置0、6.25、12.5、25、50、100、200nM PEDF處

3、理濃度。 3、通過(guò)PI和Annix V-FITC法檢測(cè)200nM PEDF對(duì)SO-Rb50凋亡的影響，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(0 nM PEDF)和陽(yáng)性對(duì)照組VCR。 4、通過(guò)RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)在常氧和低氧條件下PEDF對(duì)SO-Rb50VEGF表達(dá)的影響。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、用含50ng/ml的PEDF培養(yǎng)處理7天后，將SO-Rb50細(xì)胞接種于用多聚賴氨酸處理的六孔板中，細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞變扁平

4、，體積變稍大。自接種第1天開(kāi)始細(xì)胞呈單層貼壁或局部小團(tuán)狀或花環(huán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸由圓形向梭形生長(zhǎng)，伸出偽足樣細(xì)小的突起，成團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞于邊緣處見(jiàn)細(xì)胞伸出突起。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突起逐漸變粗變長(zhǎng)；而對(duì)照組僅在貼壁早期部分出現(xiàn)突起，中晚期并無(wú)繼續(xù)分化的趨勢(shì)。誘導(dǎo)前后SO-Rb50細(xì)胞均表達(dá)NSE和NF-200，分化后的細(xì)胞較分化前表達(dá)明顯增強(qiáng)。 2、用含6.25、12.5、25、50、100、200nMPEDF的培養(yǎng)液孵育SO-Rb

5、50細(xì)胞48小時(shí)后，MTT檢測(cè)各處理組平均OD值分別為1.099±0.147、1.190±0.147、1.344±0.452、1.102±0.351、1.007±0.269、1.037±0.175，各濃度處理組與對(duì)照組(1.030±0.090)相比無(wú)明顯差異(p>0.05)，PEDF對(duì)RB細(xì)胞增殖作用與PEDF濃度也無(wú)劑量依賴性關(guān)系(F=1.257，p>0.05)。 3、采用Annix V-FITC/PI雙染法檢測(cè)處理24小時(shí)后

6、的各樣本凋亡數(shù)，結(jié)果見(jiàn)200nM PEDF處理組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞總分?jǐn)?shù)約為3.3﹪左右，與陰性對(duì)照組(約2.5﹪)相比無(wú)明顯差異，凋亡分期也無(wú)明顯差別，而與陽(yáng)性對(duì)照組(約為14.1﹪)相比，有明顯差異。 4、RT-PCR結(jié)果顯示在常氧條件下未加PEDF和加入不同濃度的PEDF處理后的Rb50細(xì)胞均表達(dá)VEGF基因，25nM、100nM、400nM PEDF處理組相對(duì)灰度值分別為0.2709±0.0911、0.2507±0.

7、0898、0.2919±0.0941，與對(duì)照組(0.2626±0.1008)相比VEGF表達(dá)均未見(jiàn)明顯差異(p>0.05)，且各PEDF處理濃度組間VEGF表達(dá)也無(wú)明顯差異(p>0.05)。 而在低氧條件下VEGF較常氧表達(dá)是增強(qiáng)的(p<0.01)，如在低氧條件下同時(shí)加入100nM PEDF處理的Rb細(xì)胞VEGF表達(dá)量與不加PEDF處理的對(duì)照組相比是減弱的(p<0.05)。 免疫組化結(jié)果顯示常氧條件加入100nM PED

8、F培養(yǎng)的細(xì)胞VEGF表達(dá)量較對(duì)照組減弱(p<0.001)，低氧條件下可見(jiàn)VEGF表達(dá)較常氧增強(qiáng)(p<0.001)，而同時(shí)加入100nM PEDF的VEGF表達(dá)量較未加入也是減弱的(p<0.001)。 三、結(jié)論 1、PEDF可以誘導(dǎo)SO-Rb50細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，伴有神經(jīng)元標(biāo)志NSE和NF-200表達(dá)的增強(qiáng)。 2、PEDF并無(wú)直接抑制SO-Rb50細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用。 3、PEDF可以抑制SO-