百草枯致肺損傷中肌成纖維細胞的骨髓源性研究.pdf

1、背景和目的：百草枯對人畜具有高毒性，口服中毒主要吸收、聚集于肺部，引起急性肺部炎癥反應，啟動不可逆性的肺纖維化過程，最終導致大部分患者于數(shù)周內(nèi)死亡。肌成纖維細胞具有分泌細胞因子和合成細胞外基質(zhì)的雙重作用，成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化及后者的持續(xù)存在是肺纖維化發(fā)生進展的關鍵。目前關于肌成纖維細胞的來源尚無定論，本研究探討肌成纖維細胞是否源于骨髓，以及是否在百草枯致肺損傷中發(fā)揮作用，以期為百草枯的治療提供新的治療思路。 方法：以

2、密度梯度離心法分離近交系雄性：f344大鼠外周血循環(huán)成纖維細胞，培養(yǎng)10～12天，檢測細胞活力并用DAPI熒光染料標記。將30只SPF級近交系雄性f344大鼠隨機分為百草枯中毒組和正常對照組，一次性灌胃80mg/kg百草枯或等量生理鹽水制備百草枯中毒模型或正常對照組。造模后經(jīng)鼠尾靜脈注入DAPI標記的循環(huán)成纖維細胞，分別于細胞轉(zhuǎn)輸后1天、7天和14天時處死，每次5只。取肺組織固定后行HE染色觀察病理變化，測量肺泡間隔面積，采用免疫組化染

3、色檢測肺組織內(nèi)α-SMA和CD<,34>的表達，采用免疫熒光染色檢測肺內(nèi)DAPI藍色熒光表達。 結果：①外周血循環(huán)成纖維細胞分離成功，生長良好，轉(zhuǎn)輸前活細胞率90％以上。②百草枯中毒組大鼠肺組織HE染色可見進行性肺損傷，肺間質(zhì)充血水腫，肺泡腔內(nèi)炎性滲出，成纖維細胞增生及肺泡間隔增寬，在三個時間點其肺組織肺泡間隔面積均明顯增大，與正常對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P=-0.000；P=-0.000；P=0.046)。③在三個時間點，百

4、草枯中毒組α-SMA表達均高于正常對照組，具有統(tǒng)計學差異(P=0.012；P=-0.000；P=-0.000)；三個時間點百草枯中毒組α-SMA表達進行性增強，三組間比較有統(tǒng)計學差異(P=0.009)。④在各時間點，百草枯中毒組CD<,34>表達強度均高于正常對照組，但無統(tǒng)計學差異(P=-0.446；P=-0.326；P=0.594)；三個時間點百草枯中毒組組間比較無統(tǒng)計學差異(P=0.757)。⑤百草枯中毒組肺切片熒光顯色可見有較明亮

5、的藍色熒光，早期多聚集于血管周圍，后期可見肺間質(zhì)內(nèi)表達；正常對照組藍色熒光微弱或不可見。 結論：采用80mg/kg中毒量灌胃制備百草枯中毒致肺損傷模型成功，給藥方式和劑量選擇合適。隨時間不同百草枯中毒大鼠肺組織切片顯示為肺泡炎和纖維化改變。應用密度梯度離心法成功從外周血中分離出成纖維細胞，所得循環(huán)成纖維細胞能夠進行體外培養(yǎng)，并用于體內(nèi)細胞轉(zhuǎn)輸實驗。：DAPI可有效標記細胞，易于操作，標記率高。采用DAPI標記的循環(huán)成纖維細胞轉(zhuǎn)輸