一種新的肝癌標記分子的鑒定及其相關功能的初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國位居腫瘤致死率的第二位，死亡率為20.37/105[1]。目前治療原發(fā)性肝癌的方法很多，包括手術治療、放療、化療和生物治療。其中以手術切除治療為最有效的治療方法。但是，很多病人在診斷為肝癌的時候已經發(fā)生了肝內或肝外的遠處轉移而錯過了手術的最好時機。因此，早期診斷原發(fā)性肝癌對患者來說至觀重要。原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子以其方便、廉價、令人滿意的準確性被普遍用于惡性腫瘤的篩選。原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子可

2、分為四大類：①癌胚抗原和糖蛋白抗原；②酶和同工酶；③細胞因子；④相關基因。 雖然上述各種原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子在肝癌的診斷中發(fā)揮著重要的作用，但是由于它們各自的局限性，都不能單獨作為診斷指標去檢測原發(fā)性肝癌的存在，而必須通過與其他分子的聯合應用。為了尋找新的、更為特異的原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子，我們實驗室早期嘗試通過雙向電泳和基因芯片的方法對原發(fā)性肝癌組織與非腫瘤的肝臟組織相比較，除了找到一些已知的肝癌腫瘤標記分子外（如AFP

3、,VEGF,AFU 等），又發(fā)現了6 個未報道的與肝癌發(fā)生密切相關的分子，其中LIN28B 基因變化最為明顯。 研究目的:本研究旨在探討LIN-28B基因在肝癌組織及其癌旁組織，以及其他病因的肝臟正常組織中的表達差異，以便評價該基因作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子的可行性；進而通過過表達和RNA 干涉技術對LIN-28B 基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的功能進行初步的研究，為將來肝癌細胞的治療提供新的靶點。 研究方法:首

4、先構建LIN-28B的原核表達載體，誘導表達并純化融合蛋白后，常規(guī)免疫家兔，制備針對LIN-28B蛋白的兔抗人多克隆抗體；接著，運用Real-time PCR的方法檢測肝癌組織及癌旁組織和正常組織中LIN-28B在mRNA水平的表達情況，同時應用制備的兔抗人LIN-28B多克隆抗體檢測LIN-28B在蛋白質水平的表達情況；最后，構建LIN-28B基因的真核表達載體和干涉載體，分別穩(wěn)定轉染入MCF-7和HepG2細胞中，通過MTT和流式細

5、胞儀分析，觀察過表達或封閉LIN-28B基因后對細胞增殖及周期的影響。 研究結果:成功構建了LIN-28B 的原核表達載體，制備并獲得了效價為1：64000 的特異性兔抗人LIN-28B多克隆抗體。Real-time PCR分析顯示，低分化的肝癌組織中LIN-28B的陽性率為100％；中等分化的肝癌組織中該基因的陽性率為71.4％；高分化的肝癌組織中LIN-28B的陽性率只有20％。癌旁組織和正常肝組織中該基因低表達或不表達。

6、Western Blot檢測的該基因蛋白質表達情況與mRNA的結果相似。將外源性LIN-28B基因穩(wěn)轉入MCF-7細胞系（無LIN-28B 基因表達）后可明顯促進該細胞的增殖，而通過封閉HepG2細胞的內源性LIN-28B基因，則可顯著降低該細胞的增殖，并伴有細胞G1期的阻滯。 結論:本研究顯示：一方面LIN-28B蛋白的表達隨著肝癌惡性程度的增加而逐漸升高，提示該分子有可能作為一種新型的原發(fā)性肝癌的腫瘤標記分子，用于對原發(fā)性