STK15的表達對NIH3T3細胞的影響及STK15轉基因小鼠模型的建立.pdf

1、目的： STK15基因是絲/蘇氨酸激酶家族成員之一，STK15基因在多種惡性腫瘤組織中都具有高表達，其擴增和高表達能引起中心體復制擴增，染色體不穩(wěn)定性增加，最終導致細胞的惡性轉化，從而誘發(fā)惡性腫瘤?，F(xiàn)階段國內外文獻對STK15基因的功能在細胞水平的報道還很少，為了進一步研究STK15基因與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，本實驗利用pcDNA3.1-STK15質粒體外瞬時轉染成纖維細胞NIH3T3，觀察STK15高表達對NIH3T3細胞的

2、影響，并通過顯微注射法，制備攜帶STK15的轉基因小鼠，為研究該基因在惡性腫瘤中的作用，提供了很好的動物模型。 方法： 首先提取人胚肺細胞總RNA作為模版，根據GenBank中STK15基因序列設計一對引物，用RT-PCR技術擴增出1200bp的STK15基因全長，克隆到pTZ57R/T載體，通過測序證實序列的正確性。用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切空載體pcDNA3.1和pTZ57R/T-STK15連接產物，然后回收、

3、連接、轉化、鑒定，從而成功構建了pcDNA3.1-STK15表達質粒。然后將pcDNA3.1-STK15表達質粒體外瞬時轉染小鼠成纖維細胞NIH3T3，以轉染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細胞作對照，應用RT-PCR方法分析STK15在RNA水平的表達；應用免疫細胞化學方法和Western印跡方法分析STK15在蛋白質水平的表達；應用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)實驗檢測細胞的增殖能力；應用重組人工基底膜(Transw

4、ell)實驗檢測細胞侵襲能力。同時，對小鼠進行超排獲得原核期胚胎，將構建的pcDNA3.1-STK15質粒用BglⅡ和Bst1107 Ⅰ雙酶切，獲取目的基因片段，應用顯微注射法進行轉基因操作，對新生小鼠通過提取鼠尾基因組DNA、進行PCR和Southern blot方法鑒定。通過提取PCR陽性的轉基因鼠的RNA，應用RT-PCR方法分析STK15基因在轉基因陽性小鼠各組織的轉錄特征和表達情況。 結果： 重組質粒經酶切、測

5、序等分析插入的基因片段為表達STK15的基因，說明成功構建了pcDNA3.1-STK15表達質粒。然后，用脂質體介導pcDNA3.1-STK15質粒轉染小鼠的成纖維細胞NIH3T3，在轉染48小時后用RT-PCR的方法檢測到STKl5mRNA的轉錄活性明顯增強，進一步用Westem和免疫細胞化學方法檢測到STK15的蛋白表達水平明顯增強，說明轉染成功。與轉染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細胞相比，轉染pcDNA3.1-STK15質

6、粒的NIH3T3細胞48小時的MTT攝取率顯著升高(P<0.05)；Trans-well方法檢測結果顯示，與轉染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細胞相比，轉染pcDNA3.1-STK15質粒的NIH3T3細胞穿透Matrigel膠的細胞數(shù)明顯增多，說明轉染pcDNA3.1-STK15質粒的NIH3T3細胞侵襲能力明顯增強。轉基因小鼠制備實驗，共注907枚受精卵，存活701枚，注射成功率為77％，分別移入30只小鼠輸卵管，共產出106

7、只F0代轉基因小鼠。PCR檢測轉基因陽性鼠為3只，Southern雜交檢測轉基因陽性鼠一只。將轉基因陽性鼠與正常C57BL/6交配，產生F1代陽性鼠2只：將F1代陽性鼠與正常C57BL/6交配，產生F2代鼠3只。通過提取PCR檢測陽性的F0代轉基因小鼠的RNA，應用RT-PCR的方法檢測到在轉基因小鼠的睪丸組織能夠轉錄出STK15mRNA。 結論： pcDNA3.1-STK15質粒體外瞬時轉染NIH3T3細胞，可以有效地