TSG101在肺癌組織和細胞系中的表達及意義.pdf

1、人腫瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)位于11P15.1-15.2，cDNA全長1494bp，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，其編碼產(chǎn)物為含380個氨基酸分子量43KD的蛋白質。TSG101蛋白包括N-端為泛素連接酶E2樣結構域、脯氨酸富集區(qū)(人TSG101第130-205個氨基酸)和C-端螺旋卷曲結構(TSG101第231-302個氨基酸)及一個穩(wěn)定盒SB(steadiness box d

2、omain)控制其穩(wěn)定水平。TSG101基因與細胞生長密切相關，細胞TSG101含量不足或過量均能引起細胞轉化或細胞周期紊亂。研究證實TSG101N是泛素連接酶的轉錄抑制因子，只有保留螺旋卷曲結構的TSG101蛋白質才具有轉錄抑制因子調控轉錄活性。 目前，在髓系細胞白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌和宮頸癌關于TSG101的報道，但結果不盡相同。我們的實驗組前期的實驗表明，TSG101在肺鱗癌和腺癌組織中的表達低于正常肺組織，且隨

3、分化水平的降低TSG101表達水平下調。然而，其他研究表明在部分乳腺癌和宮頸癌的亞型中TSG101高表達，并且可能與TSG101基因的異常轉錄有關。目前，關于TSG101基因異常截短的轉錄產(chǎn)物和肺癌各組織學亞型的關系，國內(nèi)外鮮有報道。為此本實驗在回顧肺鱗癌和腺癌TSG101表達的基礎上，著重通過Western Blotting和RT-PCR方法檢測肺癌細胞系中TSG101及異常轉錄產(chǎn)物的表達情況，分析它們在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為闡明肺

4、癌發(fā)生機制和尋找治療肺癌的方法提供依據(jù)。 材料和方法： 1、材料 收集79例肺癌組織，取自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2005～2007年手術切除標本。其中鱗癌48例，肺腺癌31例；中、高分化51例，低分化28例；淋巴結轉移陽性者45例，淋巴結轉移陰性者34例。7株肺癌細胞系(SK和QG為肺鱗癌細胞系，661和460是大細胞肺癌細胞系，SPC和LTE是肺腺癌細胞系，446為小細胞肺癌細胞系)。 2、主要試劑和

5、來源 濃縮型鼠抗人TSG101單克隆抗體(sc-7964)購自美國Santa Cruz公司，濃縮型辣根標記山羊抗小鼠(ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。 RNA抽提試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR反應試劑盒購自大連TakaRa公司。引物序列合成由大連TakaRa公司完成。 3、方法： (1)免疫組織化學染色79例肺鱗癌和肺腺癌均行TSG101(1：200)單抗免

6、疫組織化學染色。染色方法按說明書進行。以磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline PBS)代替一抗作為陰性對照，TSG101陽性切片作為陽性對照。 (2)RT-PCR利用Triol(Invitrogen)提取細胞系總的RNA，利用RT-PCR．檢測TSG101mRNA序列及其剪接變異體，反轉錄的質量通過β-actin來檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后保存圖像。 (3)Western Blot鼠抗人TSG10

7、1單克隆抗體(1：200)，4℃孵育過夜，TBS漂洗后，加辣根酶標記山羊抗小鼠二抗(1：2000)溫育120min，最后用DAB顯色． (4)統(tǒng)計學分析應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用x2檢驗分析免疫組化結果，采用t檢驗分析Western Blot圖像灰度值和RT-PCR圖象的平均光密度值，P<0.05為有非常顯著性差異。 結果： 1、免疫組織化學染色結果盡管在正常對照的癌旁組織強表達，但是在低分化

8、的肺鱗癌和肺腺癌中微弱或無表達，在高中分化的肺鱗癌和肺腺癌中低表達，并且主要在胞漿中表達，并且發(fā)現(xiàn)在間質也有表達。TSG101的表達水平與肺癌組織分化(P<0.05)、淋巴結轉移(P<0.05)等臨床病理參數(shù)有顯著關系，隨著淋巴結轉移的增加，TSG101的陽性率下降。 2、RT-PCR結果利用檢測全長序列引物進行RT-PCR反應，發(fā)現(xiàn)除了有全長產(chǎn)物外，在488bp處發(fā)現(xiàn)有剪接變異體的產(chǎn)物，并且小細胞肺癌細胞含量較多，與Maxwe

9、ll研究的TSG101△154-1054一致。并且小細胞肺癌細胞系446與其他非小細胞肺癌細胞系相比，全長產(chǎn)物較少，而縮短的剪接變異產(chǎn)物相對較多，經(jīng)統(tǒng)計學分析，具有統(tǒng)計學意義。 為了進一步確定縮短的剪接變異體的類型，在跨過剪接點設計引物特異檢測TSG101△154-1054，同樣發(fā)現(xiàn)有預期產(chǎn)物出現(xiàn)。同樣經(jīng)過統(tǒng)計學發(fā)現(xiàn)，小細胞肺癌細胞系與非小細胞肺癌細胞系相比，具有統(tǒng)計學意義。 3、Western Blot結果七種肺癌細胞

10、系細胞中均有TSG101蛋白表達，但是小細胞肺癌細胞系表達較其他非小細胞肺癌細胞系表達明顯較低。 討論： 腫瘤易感基因TSG101(tumor susceptibility gene101)最初是被作為侯選的腫瘤抑制基因進行研究。我們的免疫組織化學染色結果也顯示，TSG101在肺鱗癌和肺腺癌中的蛋白水平顯著低于其在相應正常肺組織中的表達，并且和淋巴結轉移呈負相關。 然而，Maxwell等在乳腺癌的研究中沒有發(fā)現(xiàn)基

11、因內(nèi)部丟失或突變的證據(jù)，但是發(fā)現(xiàn)存在異常剪接轉錄體。我們利用RT-PCR分析不同組織學類型的肺癌細胞系基因轉錄情況，同樣發(fā)現(xiàn)相當于900bp(154-1054)的丟失的異常選擇性剪接體存在。 我們的Western blot的結果沒有發(fā)現(xiàn)截短的蛋白質，可能的原因是截短的蛋白質不存在野生型蛋白質的抗原表位。我們推測A類型的異常剪接體[△900bp(154-1054)]所編碼的蛋白質由于缺失區(qū)域位于羧基端，丟失了羧基末端雙螺旋結構(亮

12、氨酸拉鏈)介導的蛋白和蛋白相互作用及隨后丟失的轉錄調節(jié)作用，提示變異的轉錄產(chǎn)物編碼的截短的蛋白質不具有轉錄抑制功能。 我們的結果顯示，惡性程度較高的小細胞肺癌細胞系與其他類型的肺癌相比，全長的mRNA序列和TSG101蛋白水平下降，并且檢測出較高水平的縮短的剪接變異體，與Yun的研究一致，表明TSG101在腫瘤的不同亞型中發(fā)揮不同作用，證實了mRNA的選擇性剪接可以引起正常野生型蛋白質表達的下調，并且也說明△154-1054代表