血小板整合素β3胞漿段序列調(diào)控信號轉(zhuǎn)導的分子機制.pdf

1、整合素αⅡbβ3通過連接配體和介導雙向信號轉(zhuǎn)導，在血小板活化過程中起重要作用。整合素αⅡbβ3通過信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)血小板活化，其分子機制至今尚未完全明確。在CHO細胞模型中對截短型變異體的研究表明，整合素β3羧基端RGT序列對外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導至關(guān)重要，但對內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導并不具重要作用。為在自然狀態(tài)下的人類血小板中驗證這一機制，我們合成與整合素β3胞漿段末端RGT序列對應(yīng)的具有透膜作用的肽，使之與血小板整合素β3亞基競爭結(jié)合相應(yīng)的信號分子。

2、十四烷?；腞GT肽(Myr-RGT)可劑量依賴性地抑制正常人類血小板在固相纖維蛋白原上的粘附和伸展；將Myr-RGT肽與血小板共同孵育會導致纖維蛋白凝塊回縮功能降低。此外，RGT肽在血小板內(nèi)的存在可抑制由ADP、瑞斯托霉素或凝血酶誘導的血小板聚集，但基本不影響其一相聚集。經(jīng)凝血酶活化后，Myr-RGT肽處理的血小板膜表面CD62P表達水平明顯低于對照組。這些結(jié)果表明，經(jīng)RGT肽處理后血小板整合素的配體結(jié)合后功能即外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導受到抑制

3、。另一方面，Myr-RGT肽不影響與內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的血小板功能，如血小板的一相聚集、ADP活化的血小板與游離纖維蛋白原的結(jié)合，表明Myr-RGT肽處理的血小板的內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導途徑并未被阻斷。因此，我們首次在血小板中證實，模擬整合素β3胞漿段末端三個氨基酸序列的合成肽可選擇性調(diào)節(jié)外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，而基本不影響內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導。為進一步明確RGT肽在血小板活化信號轉(zhuǎn)導中所起作用的分子機制，我們檢測了RGT肽對整合素β3胞漿段酪氨酸磷酸化的影

4、響。我們發(fā)現(xiàn)，在誘導劑活化的血小板中，Myr-RGT肽對整合素胞漿段的兩個酪氨酸(Y747和Y759)的磷酸化有顯著抑制作用。這一現(xiàn)象可能與我們同時在免疫共沉淀實驗中發(fā)現(xiàn)的RGT肽阻止整合素β3和Src激酶的相互作用有關(guān)。我們在ELISA實驗中觀察到的Src-SH3與RGT肽的直接結(jié)合可證明RGT肽與整合素β3競爭性結(jié)合Src，這也解釋了所觀察到的RGT肽對整合素β3和Src激酶的相互作用的抑制。相反，RGT肽不干擾talin與整合素β

5、3亞基的結(jié)合。這些結(jié)果均支持一個結(jié)論，即在完整的人類血小板中，RGT肽通過干擾Src激酶與整合素β3的組成性結(jié)合而選擇性地阻斷外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，并導致整合素β3胞漿段酪氨酸磷酸化水平降低。所以，在血小板中整合素β3胞漿段RGT序列與Src激酶的相互作用是外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的必要和充分條件，而Src和整合素β3的解離對talin和整合素β3胞漿段的結(jié)合基本無影響。在血小板研究中RGT肽及其衍生物的應(yīng)用，可使我們能選擇性調(diào)節(jié)外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，而不影

6、響內(nèi)向外信號轉(zhuǎn)導，并有助于我們了解RGT肽的作用機制，尋找調(diào)節(jié)血栓形成的新的靶點。 此外，先前的研究結(jié)果證實，整合素β3羧基末端T755NITYRGT762或R760GT762序列的缺失可影響相應(yīng)細胞通過整合素αⅡbβ3的信號轉(zhuǎn)導功能，但無法排除截短型β3變異體本身因構(gòu)型改變而無法充分活化的可能。為此我們建立共表達整合素αⅡbβ3、與無胞漿片段IL-2R(Tac)連接的全長或突變型(Y759、F754截短或N756ITY759缺

7、失)整合素β3胞漿段嵌合蛋白的細胞系，并在表達整合素αⅡbβ3、糖蛋白GPIb-Ⅸ的CHO細胞株(123細胞株)中觀察由整合素β3胞漿段突變體組成的嵌合蛋白(Tac/β3)的顯性陰性作用。全長型整合素β3胞漿段嵌合蛋白的表達影響123細胞整合素αⅡbβ3的外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，其細胞伸展、穩(wěn)定粘附、纖維蛋白凝塊回縮功能受到抑制。與此相比，Y759或F754截短型以及N756ITY759缺失型整合素β3胞漿段嵌合蛋白的表達均不影響整合素αⅡbβ

8、3的親和性調(diào)節(jié)即外向內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。同時全長、截短型或缺失型的整合素β3胞漿段的顯性陰性表達完全抑制了ristocetin-vWF誘導的游離纖維蛋白原的結(jié)合，即由內(nèi)向外信號調(diào)控的整合素αⅡbβ3的活化。結(jié)果證實，在CHO細胞中整合素β3胞漿段末端序列T755NITYRGT762或R760GT762序列對整合素αⅡbβ3信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)分別通過其與胞漿中相應(yīng)信號分子的相互作用而非由截斷變異體導致構(gòu)型改變所致。因此，通過在CHO細胞中重建整合素活