以異種脫細胞角膜基質構建組織工程兔角膜前板層的實驗研究.pdf

1、角膜是構成眼屈光間質的重要組成部分，同時也是重要的天然防御屏障。目前，全球約有超過1000萬人承受著角膜盲的痛苦。迄今為止，同種異體角膜移植是治療角膜盲最有效的手段。然而，由于供體材料的匱乏，遠遠滿足不了角膜盲患者的需求。因此，尋找有效的角膜替代物用于角膜移植，是目前眼科界亟待解決的問題。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜(Keratoprosthesis)，有些已應用于臨床，然而因生物相容性差、術后并發(fā)癥較多等原因，限制了其在臨床的

2、應用。組織工程人工角膜是近年來研究熱點，由種子細胞和可降解支架材料經體外構建而成，可最大程度地模仿天然角膜結構和功能。國內外已有學者采用天然或人工合成材料進行組織工程角膜構建，取得了較大進展，但因該構建物機械力學性能不足以及光學特性不佳等原因僅能用于基礎研究。有報道證實，采用天然的材料如動物或人膠原制作支架可以增強其生物相容性。一些異種來源的細胞外基質已成功用于構建人工器官，如皮膚、心臟、血管等。我們課題組前期研究也證實，0.5％SDS

3、(Sodium Dodecyl Sulfate)處理的脫細胞豬角膜基質(Acellular PorcineCornea Matrix，APCM)具有較好的透光性、力學性能、生物安全性及生物相容性，細胞及遺傳物質被去除的同時，角膜的天然結構得到了良好的保留。然而，APCM能否應用于組織工程人工角膜構建并用于移植是本研究的重點和難點。鑒于角膜板層移植是治療一些常見角膜病的有效手段，同時能夠避免角膜內皮損傷和排斥，本研究主要開展了以異種脫細胞

4、角膜支架進行組織工程兔角膜前板層構建的研究，并成功進行動物角膜板層移植，取得了較好的效果，目前國內外尚無類似研究報道。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：兔角膜細胞的培養(yǎng)及APCM的制備。
　　 目的：探討應用無血清培養(yǎng)基KSFM培養(yǎng)兔角膜上皮、基質及內皮細胞的可行性，同時對脫細胞方法進行改良以制備.APCM用于組織工程人工角膜前板層構建。
　　 方法：⑴兔角膜細胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下獲取新西蘭大白兔眼角膜，

5、仔細去除虹膜、結膜及多余鞏膜，解剖顯微鏡下撕下內皮層用于組織塊培養(yǎng)；將去內皮角膜組織置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h，獲取角膜上皮片，經0.25％胰酶-0.02％EDTA獲取上皮細胞懸液進行培養(yǎng)；剩余角膜基質剪碎成1mm×1mm大小，置于0.5mg/ml膠原酶Ⅰ37℃消化過夜，獲取基質細胞懸液。將3種細胞各分為2組，即KSFM培養(yǎng)組和含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)組，置于六孔板內培養(yǎng)，每種細胞每組3個孔，各接種8個板，

6、觀察各培養(yǎng)條件下的細胞形態(tài)，細胞計數法描記生長曲線；⑵APCM的制備及去細胞效果檢測：改良脫細胞制作方法，無菌條件下將處理后的新鮮豬角膜置于0.5％SDS溶液4℃振搖4h×6次，不含雙抗PBS沖洗2h×8次，含雙抗PBS沖洗1h×3～6次獲取無菌APCM，進行以下檢測：1)H.E.及DAPI檢測脫細胞角膜基質內細胞及遺傳物質的殘留；2)MTT實驗檢測材料浸提液對角膜上皮、基質及內皮細胞生長曲線的影響；3)電鏡觀察材料的結構及有無細胞殘留

7、。
　　 結果：①KSFM組：培養(yǎng)2d，上皮細胞形成克隆團，基質細胞貼壁呈樹枝狀，內皮細胞未見爬出；培養(yǎng)7d，上皮細胞緊密連接呈片狀(密度達到90％～100％)，基質細胞呈樹枝狀(密度達70～80％)，內皮細胞連接緊密，形態(tài)不規(guī)則；傳代后，細胞生長緩慢或不生長，漂浮細胞較多；②含10％FBS的DMEM/F12組：培養(yǎng)2d，上皮細胞形成克隆團，基質細胞呈梭形，內皮細胞可見有少量細胞爬出；培養(yǎng)5d，上皮呈鵝卵石樣已達60％密度，基質

8、細胞呈梭形達70～80％密度，可見大量內皮細胞從內皮片組織周邊爬出，呈不規(guī)則狀；上皮和基質細胞培養(yǎng)7d傳代，內皮細胞培養(yǎng)10d后傳代，生長狀態(tài)均良好，基質細胞可傳10代。KSFM培養(yǎng)的上皮和基質細胞的生長曲線與含血清培養(yǎng)基相比差異有統計學意義(P<0.05)。③MTT實驗證實APCM浸提液對角膜上皮、基質及內皮細胞生長曲線無影響(P>0.05)；H.E.及DAPI證實材料內無細胞成分殘留；電鏡示材料結構完整，膠原排列整齊。
　　

9、 結論：KSFM可用來培養(yǎng)角膜上皮、基質及內皮細胞，但細胞生長較緩慢，易死亡；APCM經改良的脫細胞方法處理效果良好，可用來進行組織工程人工角膜構建。
　　 第二部分：組織工程兔角膜前板層的體外構建。
　　 目的：探討以APCM為支架體外構建含角膜上皮和基質細胞的組織工程兔角膜前板層的可行性。
　　 方法：解剖顯微鏡下獲取含前彈力層的APCM薄片(厚約1～2mm、直徑7mm)，置于培養(yǎng)基內37℃下浸泡24h，以備

10、接種細胞。胰酶消化獲取3代兔角膜基質細胞懸液，調整細胞終濃度為5×105/ml，應用lml胰島素空針平行于APCM前彈力層平面，將1ml基質細胞懸液沿著材料邊緣接種于內靜置培養(yǎng)24h，而后置于搖床上振搖培養(yǎng)7d；將1代角膜緣上皮細胞以5×103/mm2的密度接種于構建物表面，等待2h待細胞貼附于材料表面后，輕輕添加培養(yǎng)基靜置再培養(yǎng)7d，構建同時含角膜上皮和基質細胞的組織工程兔角膜前板層。將接種基質細胞培養(yǎng)8d后的構建物再貼壁培養(yǎng)7d，觀

11、察有無細胞從角膜周邊爬出，間接鑒定構建物內基質細胞活性；分別于3d、8d、15d取材進行H.E.染色，觀察構建物細胞生長情況及組織結構；免疫染色檢測角膜上皮細胞特異性標志物CK3和基質細胞標志物Vimentin的表達；取15d構建物標本分別進行免疫染色檢查和掃描電鏡觀察。兔角膜前板層的三維構建過程均采用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 結果：構建物再貼壁培養(yǎng)5d，可見有大量基質細胞爬出，間接證實材料內細胞活性。

12、H.E.染色示構建物結構完整，未見明顯的結構改變，膠原纖維間隙較大；3d，可見基質內有細胞生長，密度分布不均勻，膠原排列較規(guī)則；8d，可見基質內生長大量細胞，密度較均勻，膠原纖維間隙較大，排列整齊；15d，材料內仍分布大量細胞，表達基質細胞標志物Vimentin，密度較均勻，材料表面有2～3層細胞，表達上皮細胞標志物CK3，膠原排列整齊，纖維間隙較大。掃描電鏡示膠原纖維水腫膨脹明顯，部分區(qū)域見有膠原纖維斷裂，膠原排列較整齊，可見有梭形的

13、基質細胞附著生長。經過100％無菌甘油脫水，構建物能夠恢復透明，表明APCM經過細胞接種再培養(yǎng)過程，三維結構保持良好。
　　 結論：APCM可用于組織工程人工角膜的構建；構建物具有正常兔角膜的表型，且脫水后能恢復透明，驗證了該三維培養(yǎng)方法的可行性，為兔角膜全層和人角膜的構建奠定了實驗基礎。
　　 第三部分：組織工程兔角膜前板層的動物移植實驗。
　　 目的：初步探討體外構建的兔角膜前板層體內移植后的生物學功能。

14、r>　　 方法：1.5～2 kg新西蘭大白兔20只隨機分為兩組，即構建物移植組和APCM空支架組，每組10只，各組均以右眼做術眼，左眼做陰性對照。術前3d術眼滴用抗生素，3％戊巴比妥鈉(1ml/kg)經耳緣靜脈進行麻醉，含慶大霉素生理鹽水沖洗結膜囊，制備6.5mm直徑大小角膜植床，采用國產10-0尼龍線對位縫合7mm直徑大小植片至植床(共16針)，并覆蓋羊膜，結膜下隔日注射慶大霉素及地塞米松，合并應用典舒眼水(3次/天)，構建物移植組

15、術后1個月拆線。分別于1d、3d、7d、14d、21d、28d觀察以下指標：結膜充血、水腫、分泌物，角膜水腫、混濁、浸潤、新生血管、炎癥反應，熒光素染色觀察角膜上皮的完整性；術后5周進行活體共聚焦檢查；于1周、2周、4周取材經4％多聚甲醛及3％戊二醛固定，分別進行組織學檢查及掃描電鏡觀察。
　　 結果：⑴構建物移植組：術后1周，羊膜脫落，結膜輕度充血水腫，角膜上皮已覆蓋大部分植片，未見有角膜新生血管，虹膜紋理可見，組織學檢查見植

16、片內膠原排列規(guī)則整齊，有少量細胞分布，植片與植床邊界清晰，材料表面可見1～2層上皮細胞；術后2周，結膜輕度充血，中央角膜輕度混濁，未見有新生血管，植片表面有小部分區(qū)域上皮缺損，但可見虹膜紋理，組織學檢查見材料表面分布有類似正常角膜的上皮結構，植片內部結構完整，膠原排列規(guī)則整齊，有細胞分布；術后4周，結膜充血水腫加重，植片表面不光滑，但較透明，可見角膜新生血管分布在周邊區(qū)域，上皮已覆蓋大部分植片，虹膜紋理可見，組織學檢查同術后2周，掃描電

17、鏡示植片表面上皮排列與正常角膜已無明顯差異；術后5周(已拆線1周)，結膜充血水腫消失，植片區(qū)域角膜較透明，有輕微瘢痕形成，大部分新生血管已退去，虹膜紋理清晰，植片區(qū)域可見點狀熒光素著色，激光共聚焦顯示術眼角膜內皮密度及形態(tài)均正常。⑵APCM空支架組：術后4周內角結膜反應情況相似于構建物移植組，但上皮始終無法完全覆蓋植片表面，中央角膜呈現中度混濁狀態(tài)，但仍可透見虹膜。組織學檢查見植片膠原排列較規(guī)則，無明顯結構改變，但與受體角膜分界明顯；植