不同血清型肺炎鏈球菌LytA基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)研究.pdf

1、研究目的構(gòu)建肺炎鏈球菌常見(jiàn)致病血清型19F、14、6A、23F及6B菌株以及北京標(biāo)準(zhǔn)株31108的LytA基因的原核重組質(zhì)粒,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行分析,了解不同血清型LytA基因核苷酸及氨基酸序列間的異同及遺傳關(guān)系.進(jìn)行原核重組表達(dá),利用Western Blot分析對(duì)其抗原性進(jìn)行初步研究,為開(kāi)發(fā)肺炎鏈球菌疫苗及新藥奠定基礎(chǔ).研究方法(1)藥物敏感性實(shí)驗(yàn):運(yùn)用紙片法和青霉素E-test檢測(cè)所收集的19F、14

2、、6A、23F和6B血清型肺炎鏈球菌以及肺炎鏈球菌北京標(biāo)準(zhǔn)株31108的耐藥情況.(2)LytA基因的克隆:分別提取以上6株不同血清型肺炎鏈球菌的基因組DNA.根據(jù)已知肺炎鏈球菌野生R6株LytA基因序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將獲得的目的基因片段克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1.雙酶切和測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定.(3)不同血清型LytA基因的序列分析:利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行LytA基因的DNA及推測(cè)蛋白質(zhì)序列的分析、比對(duì).并對(duì)推測(cè)

3、的蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)及可能的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè).(4)LytA基因的重組表達(dá)及純化:誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-LytA,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析.利用GSTrap.FF親合層析柱和Thrombin,獲得純化重組LytA蛋白.(5)重組LytA的質(zhì)譜分析:利用基體輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)對(duì)所獲得純化蛋白產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.(6)重組蛋白的免疫學(xué)研究:分別用肺炎鏈球菌血清型19F的Ly

4、tA融合蛋白凝膠-PBS懸液和菌液免疫大鼠,獲得血清,雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和直接凝集反應(yīng)(試管法)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.Western Blot分析重組LytA蛋白分子的抗原性;交叉Western Blot分析不同血清型間重組LytA蛋白抗原性的異同.小結(jié)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證明我們所研究的5株國(guó)內(nèi)常見(jiàn)致病血清型的肺炎鏈球菌菌株均為多重耐藥株及青霉素低度耐藥株.從不同血清型肺炎鏈球菌基因組DNA中均擴(kuò)增出了LytA基因序列,成功構(gòu)建了6個(gè)重組質(zhì)粒pGEX