尼古丁對人氣道上皮基因組和蛋白組學的影響.pdf

1、目的：
　　吸煙是引起慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD）的主要原因。氣道重塑是COPD不可逆性氣流受限的主要原因。一般認為，COPD氣道重塑的機制與炎癥細胞活化、氧化抗氧化失衡、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡等有關。最近，越來越多的研究表明上皮間質轉分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT）參與了氣道重塑

2、的發(fā)生。氣道上皮作為抵御外來損傷因素的第一道防線，吸入的煙草煙霧進入人體最先直接接觸人體的氣道。尼古丁是香煙煙霧中的主要有害成分。尼古丁對氣道上皮的直接影響目前還不清楚。本研究首次采用基因芯片技術和雙向凝膠電泳技術觀察尼古丁刺激人氣道上皮細胞后差異基因和蛋白的表達情況，為進一步闡明氣道重塑機制提供線索。
　　方法：
　　一、體外培養(yǎng)原代人小氣道上皮細胞，待原代人氣道上皮細胞生長至80％融合時，換用無生長因子的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)2

3、4小時，使細胞同步于靜止期。將細胞隨機分成兩組，每組再分成兩個平行組，即尼古丁刺激4小時組和空白對照組，尼古丁刺激48小時組和空白對照組。實驗組加入尼古?。?310-5M），對照組加入PBS，分別孵育4小時和48小時后吸走，加入Trizol試劑，收集細胞用于基因芯片檢測。
　　二、根據(jù)基因芯片結果，選取部分表達差異基因用熒光定量PCR方法進行驗證。
　　三、體外培養(yǎng)人支氣管上皮細胞16HBE,待16HBE細胞生長至80%融合

4、時，換含1%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使細胞同步于靜止期。采用隨機化的原則進行分組：（1）對照組，加入PBS；（2）實驗組，加入尼古?。ńK濃度1310-5M），孵育72小時后加入裂解液收集細胞用于雙向凝膠電泳。通過雙向凝膠電泳實驗分離總蛋白，差異表達蛋白質點應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜獲取肽質量指紋圖譜并通過 NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定。
　　結果：
　　一、基因芯片結果
　　（1）尼古丁處理4h后，表達

5、上調的基因有63個，表達下調的基因有44個，主要涉及細胞對外界刺激的應激反應有關基因。
　?。?）尼古丁處理48h后，表達上調的基因有860個，表達下調的基因有582個。對差異基因進行Gene GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異基因涉及到胚胎發(fā)育、細胞極性維持、細胞與細胞黏附等與細胞轉分化相關的重要生理過程和信號轉導通路。
　　（3）進一步對個別基因進行分析，發(fā)現(xiàn)尼古丁可以下調上皮角蛋白（CK）、上皮黏蛋白（MUC）等具

6、有上皮特征的基因；上調纖維連接蛋白1（FN1）、N鈣粘蛋白（N-cadherin）等具有間質細胞特征的基因。
　　二、熒光定量PCR結果熒光定量PCR驗證的基因差異表達與基因芯片結果變化趨勢一致。
　　三、雙向凝膠電泳結果
　　雙向凝膠電泳圖譜中找到23個表達量有明顯差異的蛋白質點，質譜鑒定出19種蛋白質。其中與細胞骨架相關的蛋白明顯下調，如微管蛋白、γ1-肌動蛋白等。
　　結論：
　　不論從基因組水平還是