實時定量PCR技術在油菜菌核病菌對多菌靈抗藥性監(jiān)測中的應用研究.pdf

1、　　油菜菌核病是我國油菜主要產區(qū)的重要病害，嚴重影響著油菜生產，目前防治菌核病的藥劑主要是以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑。由于這類藥劑的高度?；?，作用位點單一，加上施用頻率高，一般使用2～3年后許多病原菌很快會出現抗藥性問題?，F有研究證明，β-微管蛋白198位氨基酸由谷氨酸(G1u)突變?yōu)楸彼?Ala)是導致核盤菌產生對多菌靈田間抗藥性的主要原因?！　”疚母鶕﨧BCHR菌株的點突變設計了2種實時定量PCR檢測方法：第一種方法利用兩

2、條兩端分別標記了不同發(fā)光基團的Taqman熒光探針可以與各自模板特異性結合發(fā)出不同熒光的原理來定量敏感和抗性核盤菌的數量；第二種方法在ASO-PCR檢測技術的基礎上結合了SYBRGREENI熒光染料可以與雙鏈DNA結合發(fā)光的的原理實現了對抗性核盤菌和全體樣本的實時定量檢測?！　≡赥aqman熒光探針實時定量PCR方法的研究中，設計了一對可以擴增出包含突變位點片段的通用引物TYF、TYR和敏感探針及抗性探針。實驗中表明TaqMan熒光探

3、針多重定量PCR技術不適用于油菜菌核病菌對多菌靈抗藥性突變這一單堿基的點突變類型的檢測?！　≡赟YBRGREENI熒光染料實時定量PCR方法的研究中，根據ASO-PCR檢測的原理用198位突變密碼子作為3'末端堿基設計了1對引物RFP4、RRP來擴增產生突變的抗性核盤菌β-微管蛋白基因片段，根據S.sclerotiorumβ-微管蛋白基因內含子與其它常見絲狀真菌的差異設計了特異性引物SclSF、SclAF來擴增核盤菌的特異性片段，這樣

4、通過這兩對引物的特異性保證了檢測的可靠性和準確性；在定量方法上，選用SYBRGREENI熒光染料使檢測靈敏度大為提高，可以檢測出O.0028ng(3.17×103copy)的模板含量，是普通ASO-PCR方法的十倍以上；采用從菌核直接提取基因組DNA的方法，并且不需要對每個菌株單獨處理，大大節(jié)省了檢測時間和工作量?！　⊥ㄟ^SYBRGREENI熒光染料實時定量PCR法建立了油菜菌核病菌對多菌靈田間抗藥性檢測的定量標準曲線方程。根據方程對