苯妥英鈉停藥對氨基酸遞質及相關代謝酶和轉運體的影響.pdf

1、目的：近年來星形膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)中的作用正日益受到重視,而且星形膠質細胞與癲癇的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關系。本課題旨在通過研究苯妥英鈉(Phenytoin Sodium)慢性作用及停藥后對人星狀膠質細胞(humanastrocytes,HA)氨基酸遞質的釋放以及與之密切相關的多種代謝酶及轉運體mRNA表達的影響,探討星形膠質細胞在苯妥英鈉抗癲癇機制以及停藥反跳機制中所起的作用,以期為更好地預防和控制苯妥英鈉停藥反跳以及新型抗癲癇藥物

2、的研究與開發(fā)提供實驗依據。
　　 方法：本實驗用人星狀膠質細胞建立苯妥英鈉慢性作用的星形膠質細胞模型。從氨基酸遞質釋放、mRNA表達和蛋白表達三個水平以及停藥后0小時、12小時、24小時、36小時、48小時和60小時六個時間點來檢測苯妥英鈉慢性作用后快速停藥對HA細胞的影響。本實驗采用高效液相色譜(High performanceliquid chromatography,HPLC)檢測HA細胞天門冬氨酸(Aspartate,A

3、sp)、谷氨酸(Glutamatc,Glu)、天門冬酰胺(Asparatmine,Asn)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的釋放量；采用實時熒光定量PCR方法檢測與這些氨基酸代謝相關的酶及其轉運體mRNA表達水平的變化,包括谷氨酸脫氫酶(GLUD1)、谷草轉氨酶1(GOT1)、谷草轉氨酶2(GOT2)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷氨酰

4、胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉運體(SLC1A6)、神經遞質轉運體(SLC6A12)、中性氨基酸轉運體(SLC6A15、SLC6A19)、谷氨酸脫羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉氨酶(ABAT)、谷氨酸轉運體1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉運體(GLAST)、GA

5、BA轉運體3(GAT-3)；用western blot方法檢測谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GLUL)蛋白表達水平的變化。
　　 結果：1、苯妥英鈉慢性作用可促進HA細胞Gly和GABA的釋放,抑制Glu的釋放,而對Gln,Asn和Asp的釋放的影響沒有統(tǒng)計學意義。停藥后Glu、Gly和GABA的釋放呈反跳樣變化。
　　 2、實時熒光定量PCR檢測結果顯示,苯妥英鈉慢性作用使谷氨酸脫羧酶1(G

6、AD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、谷氨酸轉運體l(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉運體(GLAST)mRNA相對表達量升高,使甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉氨酶(ABAT)、GABA轉運體3(GAT-3)的mRNA相對表達量降低,停藥后這些基因的mRNA相對表達量呈反跳樣變化。谷氨酸脫氫酶(GLUD1)、谷草轉氨酶1(GOT1)、谷草轉氨酶2(GOT2)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL

7、)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉運體(SLC1A6)、神經遞質轉運體(SLC6A12)、中性氨基酸轉運體(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相對表達量在給藥和給藥停藥后沒有發(fā)生顯著性變化。
　　 苯妥英鈉慢性給藥后及給藥停藥后,對HA細胞的GLUL蛋白的變化沒有可檢測到的影響,這與之前的氨基酸檢測、氨基酸代謝酶及相關轉運體的檢測結果相吻合。

8、　　 結論：采用HPLC檢測HA細胞在苯妥英鈉慢性作用及停藥后Asp、Glu、Asn、Gln、Gly和GABA釋放量的變化。結果顯示,苯妥英鈉慢性作用可促進HA細胞Gly和GABA的釋放,抑制Glu的釋放,而對Asn、Asp和Gln的釋放的影響沒有顯著性意義。提示苯妥英鈉慢性作用后停藥可引起HA細胞Glu、Asp和GABA的釋放呈反跳樣變化,對Asn、Asp和Gln的釋放的影響也沒有顯著性意義。實時熒光定量PCR檢測結果顯示,苯妥英鈉

9、慢性作用使與之相關的一些代謝酶及轉運體如谷氨酸脫羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、谷氨酸轉運體1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉運體(GLAST)mRNA相對表達量升高,甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉氨酶(ABAT)、GABA轉運體3(GAT-3)的mRNA相對表達量降低,停藥后這些基因的mRNA相對表達量呈反跳樣變化。提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生可能有關。谷氨酸脫氫酶(GLUD1

10、)、谷草轉氨酶1(GOT1)、谷草轉氨酶2(GOT2)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉運體(SLC1A6)、神經遞質轉運體(SLC6A12)、中性氨基酸轉運體(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相對表達量在給藥和給藥停藥后沒有發(fā)生顯著性變化。提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生可能沒有關系。
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11、estern blot結果顯示,苯妥英鈉慢性作用對HA細胞的GLUL蛋白表達沒有可檢測到的變化。給藥后GLUL蛋白表達與給藥組、對照組,也沒有可檢測到的差異,說明GLUL蛋白可能與苯妥英鈉停藥反跳發(fā)生的機制無關。
　　 可見,苯妥英鈉慢性作用后停藥可引起HA細胞Glu、Asp和GABA的釋放呈反跳樣變化,與之相關的一些代謝酶及轉運體mRNA表達水平也出現相應的反跳樣變化,提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生有關。由此推測星形膠質