分子對接方法及HIV整合酶抑制劑的設計研究.pdf

1、蛋白質分子是生命活動的重要物質，它與包括自身在內的生物分子的相互作用是生命自組織復雜體系得以正常調控運轉的分子基礎，一直備受生命科學領域的關注，是二十一世紀生命科學研究的前沿與熱點。繼人類基因組計劃之后，生命科學已經進入功能基因組時代，以蛋白質聚集體間相互作用與識別為核心內容的蛋白質組學研究迅速興起，已被廣泛應用于生命科學的許多領域，具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位。 隨著計算機處理能力的不斷增強，理論模擬方法也得到了迅速發(fā)展和廣泛應用。

2、采用分子對接方法進行蛋白質復合物結構預測，已成為蛋白質聚集體間相互作用和識別研究的有力手段，并可為實驗工作提供有益的理論指導。如何得到更多正確的對接結構，然后如何有效快速地篩選出近天然結構，仍然是蛋白質-蛋白質對接方法學所面臨的關鍵問題和挑戰(zhàn)。所以，本論文的第一部分工作圍繞蛋白質-蛋白質對接方法學研究上的兩個主要難點，進行深入的研究和探討。 在蛋白質結構和功能的研究中，發(fā)現(xiàn)許多蛋白與疾病的發(fā)生和防治相關，是新藥研發(fā)的理想靶標。在

3、艾滋病的病原體人體免疫缺陷病毒(HIV)復制過程中，有三種酶起著關鍵作用。其中，整合酶負責將病毒cDNA整合到宿主細胞的DNA中，而且在人體正常細胞中并無其功能的類似物，是研發(fā)抗HIV藥物的一個非常有意義的靶點。由于整合酶蛋白的溶解度小，全酶的晶體結構一直沒有獲得，而且受整合酶體外抑制劑篩選實驗的限制，使得整合酶靶向藥物設計進展緩慢，到目前為止還沒有整合酶抑制劑上市。因此，本論文的第二部分工作以HIV整合酶為研究對象，采用計算機輔助藥物

4、設計方法進行了HIV-1整合酶抑制劑的設計、改造和虛擬篩選。在此基礎上，為了進一步獲得有活性的HIV-1整合酶抑制劑，積極籌建酶學測活方法平臺，開展了HIV-1整合酶的表達和純化等生化實驗工作(見論文第三部分)。 本論文主要內容包括以下三個部分：1.蛋白質-蛋白質對接方法的研究發(fā)展了基于結合位點信息的蛋白質-蛋白質分子對接方法。本工作在FTDock分子對接程序基礎上，把蛋白質的結合位點信息整合到分子對接幾何采樣的旋轉平移過程中。

5、對10個目標復合物的對接預測結果顯示，該方法可以獲得更多的近天然結構，而且最優(yōu)對接結構的配體均方根偏差(RMSD)也有明顯的降低。同時，通過多構象疊合的方法在分子對接中考慮蛋白質復合物的主鏈柔性，提高了分子對接的效果。 提出了基于蛋白質-蛋白質復合物類型的組合打分函數(shù)。根據(jù)復合物的界面性質，將64個復合物劃分為四種類型，即蛋白酶/抑制劑、抗原/抗體、其它酶/抑制劑和其它類型復合物。該打分函數(shù)組合了蛋白質復合物形成過程中的各種能量

6、，包括界面殘基成對偏好性(RP)、去溶劑化自由能(ACE)、靜電相互作用以及范德華相互作用，應用多元線性回歸方法來擬合組合函數(shù)的各項權重。結果顯示，基于復合物類型的組合打分函數(shù)明顯地提高了單獨能量項對近天然結構的評價能力，對蛋白酶/抑制劑、抗原/抗體和其它酶/抑制劑復合物的對接結果較一些常用的打分函數(shù)的評價能力有明顯的改善和提高。 2.HIV-1整合酶抑制劑的設計研究對一類具有較高活性和特異性的整合酶抑制劑——苯乙烯基喹啉類衍生

7、物(SQLs)進行三維定量構效關系(3D-QSAR)及其與整合酶的結合模式研究，并進行了合理的結構改造。采用了比較分子場分析方法(CoMFA)，得到了一組能夠較好預測SQLs抑制活性的CoMFA模型，并給出了影響這類化合物生物活性的相關結構信息。對接結果顯示，SQLs的喹啉環(huán)上7-位羧基和8-位羥基與靶酶活性區(qū)域中鎂離子形成鰲合作用；預測的結合能與抑制劑的活性也有很好的線性關系?；谏鲜鼋Y果，采用從頭藥物設計方法對該類抑制劑進行了合理的

8、結構改造和設計，并進行分子對接模擬和聚類分析，獲得了在已知SQLs中沒有的4類新化合物結構。 同時，運用計算機模擬方法對界面多肽抑制劑進行了突變設計研究。基于整合酶二聚體的模建結構，采用分子動力學模擬方法分析二聚體間的相互作用，提取界面肽段與整合酶單體的作用信息?；诮缑娑嚯囊种苿?α1和α5螺旋)進行虛擬殘基突變，并對設計的多肽分子的二級結構以及其與整合酶單體的作用模式進行預測。結果顯示，與α1和α5的螺旋性和結合能相比，部分

9、設計的多肽分子的螺旋性和結合能有明顯改進。 另外，還進行了數(shù)據(jù)庫虛擬篩選，用來尋找新的整合酶抑制劑。在篩選中，基于整合酶核心結構域的三維結構，采用DOCK4.0程序，對ACD、MDDR、NCI小分子數(shù)據(jù)庫(約258萬個化合物)和中國草藥數(shù)據(jù)庫(約1萬個化合物)進行計算機虛擬篩選。對篩選出來的小分子進行聚類分析和類藥性評價，提出可能有抑制整合酶活性的化合物結構。最后，選取了打分排序和類藥性較好的7個化合物分子并委托公司進行合成，相

10、關的抗整合酶活性和抗病毒活性的實驗正在進行中。 3.HIV-1整合酶的表達和純化研究為了建立整合酶酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)并進行體外抑制劑的篩選，完成了HIV-1整合酶的表達和純化工作。本論文以HIV-1B亞型國際標準株pol基因為模板克隆出整合酶基因，將其插入pET28a(+)原核表達載體。通過重疊PCR方法對第185位苯丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔瑯嫿酥亟M質粒pET28a(+)/IN(F185K)，在體外大腸桿菌表達系統(tǒng)中以包

11、涵體形式表達整合酶。通過對包涵體變性后，利用鈷離子親和層析柱純化，獲得了純度達85％以上的整合酶蛋白。對整合酶進行復性，采用ELISA實驗檢驗復性后的整合酶蛋白具有3’-末端鏈和鏈轉移反應活性。通過本實驗工作的進行，構建以蛋白為靶點的抑制劑篩選研究平臺，為將理論設計與實驗檢驗相結合進行整合酶抑制劑的篩選工作奠定了良好的基礎。同時，通過本實驗工作的進行，構建以蛋白為靶點的抑制劑篩選研究平臺，為將理論設計與實驗檢驗相結合進行整合酶抑制劑的篩