中間絲蛋白Nestin在腎小管上皮細胞轉分化中表達的研究.pdf

1、第一部分、中間絲蛋白Nestin在間質纖維化動物模型腎小管上皮細胞轉分化中表達的研究
　　 背景：腎小管間質纖維化是一系列慢性。腎臟疾病進展到終末期腎病的決定性因素之一，腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化(Epithelial-myofibroblast transition，EMT)在間質纖維化過程中發(fā)揮了重要的致病作用。巢蛋白(Nestin)屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，可能在各種細胞骨架蛋白中起橋梁作用，參與調節(jié)整個細胞骨架結構的

2、穩(wěn)定。我們先前的研究于國內外率先發(fā)現：在腎臟發(fā)育階段，Nestin-過性表達于分化未成熟的小管上皮細胞，而在分化成熟的小管上皮細胞中再無表達。腎間質纖維化時，由于EMT過程涉及腎小管上皮細胞的去分化以及細胞形態(tài)和遷移能力的改變，因而腎小管發(fā)育階段曾表達的Nestin有可能重新表達于腎小管上皮細胞并發(fā)揮一定的作用。因此，我們通過構建單側輸尿管梗阻(UUO)的腎間質纖維化動物模型，觀察腎小管EMT過程中是否出現Nestin的表達。
　

3、　 方法：選用60只200—250g雄性SD大鼠，建立UUO動物模型，以假手術大鼠為對照，分別于手術后3天、6天、11天和14天處死大鼠。Masson染色觀察大鼠間質纖維化情況，免疫組化法檢測大鼠TGFβ1、上皮細胞表型特異性標志物E-鈣粘蛋白、肌成纖維細胞表型標志物.平滑肌肌動蛋白α(αSMA)及Nestin在腎臟的表達；免疫熒光共染色檢測Nestin和E-鈣粘蛋白/αSMA表達的關系；實時定量PCR法檢測大鼠皮質Nestin mR

4、NA水平；Western blot法檢測Nestin、E-鈣粘蛋白和αSMA的蛋白水平；Pearson法分析Nestin改變與皮質間質容量分數及E-鈣粘蛋白、αSMA蛋白表達的相關性。
　　 結果：與對照大鼠比，隨著輸尿管梗阻時間的延長，大鼠腎間質纖維化面積逐漸增加，術后3天為2.1％，6天達到12.2％，11天時為18.0％，14天間質有近30％的面積出現纖維化，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。UUO大鼠的間質和小管內出現TG

5、Fβ1的表達。與此同時，隨梗阻時間延長，UUO大鼠腎小管上皮表型E-鈣粘蛋白表達下降，11天時下降明顯，14天時表達量幾乎無法檢測到(UUO11d0.34±0.041，UUO14d0.02±0.007 vs CON1.19±0.087，P<0.05)；肌成纖維細胞表型αSMA自術后3天即呈時間依賴性增加(與對照比P<0.05)。大鼠小管EMT的同時，間質和小管部位先后出現Nestin的表達，熒光染色顯示UUO6天時大鼠Nestin表達于

6、E-鈣粘蛋白缺失的小管上皮，并部分與αSMA共表達。隨手術時間延長，Nestin mRNA和蛋白水平均呈時間依賴性增加。Nestin蛋白水平與間質纖維化程度(r=0.816，P<0.05)及αSMA蛋白水平(r=0.97，P<0.05)呈正相關，與E-鈣粘蛋白水平呈負相關(r=-0.816，P<0.05)。
　　 結論：(1)在UUO間質纖維化動物模型中，存在著腎小管上皮細胞的轉分化；(2)伴隨著EMT的發(fā)生，分化未成熟小管上皮

7、細胞標志物Nestin再次表達；(3)Nestin的表達與腎間質纖維化程度及細胞表型特異性標志物的改變密切相關。
　　 第二部分、Nestin在體外培養(yǎng)的人近端小管上皮細胞轉分化中的研究
　　 背景：腎小管上皮細胞是腎臟中生理功能最活躍的細胞之一，各種損傷因素，如缺血、缺氧、蛋白尿以及免疫炎癥均可導致小管上皮細胞的損傷，損傷的小管上皮細胞發(fā)生活化，其細胞運動、遷移、吞噬等能力顯著增強。而腎小管上皮細胞在組織發(fā)生過程中與間

8、質成纖維細胞具有同源性，在一定的病理條件下可以發(fā)生上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化，直接參與腎間質纖維化損傷過程。Nestin作為中間絲蛋白的一種，在調控整個細胞骨架蛋白網絡結構的穩(wěn)定性中具有一定的作用，在腎臟發(fā)育早期，Nestin表達于分化未成熟的小管上皮細胞，參與其分化過程。我們前一部分的動物研究已經證實，分化未成熟小管上皮細胞標志物Nestin在腎間質纖維化小管EMT的過程中再次表達。因此，本部分研究將以體外培養(yǎng)的人近端小管上皮細胞(

9、HKC)為觀察對象，用TGFβ1誘導其轉分化，體外驗證小管EMT時，Nestin是否重新表達及其與腎小管上皮細胞去分化表型改變及細胞遷移能力的關系。
　　 方法：體外人近端小管上皮細胞(HKC)培養(yǎng)，以5ng/l轉化生長因子β1(TGFβ1)干預不同時間，以非干預組為對照。實時定量PCR法檢測Nestin mRNA水平，免疫熒光法及Western blot法檢測Nestin、E-鈣粘蛋白、αSMA的表達，Transwell遷移實

10、驗檢測細胞遷移能力。
　　 結果：YGFβ1干預HKC72小時后，細胞形態(tài)由鵝卵石樣變?yōu)殚L梭形。E-鈣粘蛋白呈時間依賴性下調，6小時，12小時，24小時，36小時后分別比未干預組下降25.7％，62.0％，84.2％和92.8％(P<0.05)，而48小時后，E-鈣粘蛋白表達完全缺失；基礎狀態(tài)下，HKC內無αSMA表達，TGFβ1干預36小時后，HKC中可檢測到αSMA蛋白表達陽性，提示體外培養(yǎng)的HKC發(fā)生轉分化。轉分化后HKC

11、細胞遷移能力顯著增強，為對照細胞的15.37倍(P<0.05)。Nestin的mRNA水平自TGFβ1作用6小時后，即出現上調，比對照組增加了17.2％(P=0.04)，隨TGFβ1作用時間的延長，Nestin mRNA的水平呈時間依賴性增加；Nestin的蛋白水平自24小時起開始增加，24小時，36小時，48小時和72小時分別比對照組增加了14.6％、95.5％、104.1％和100.8％(與對照組相比，P<0.05)。Nestin蛋

12、白表達的出現要早于E-鈣粘蛋白表達的完全缺失及αSMA蛋白的表達的出現。
　　 結論：(1)TGFβ1可以誘導體外培養(yǎng)的HKC轉分化，表現為上皮細胞表型E-鈣粘蛋白的下調和肌成纖維細胞表型αSMA的出現及細胞遷移能力的增強；(2)HKC轉分化的同時，分化未成熟小管上皮細胞標志物Nestin再次表達，其蛋白表達早于上皮表型E-鈣粘蛋白的缺失及肌成纖維細胞表型αSMA的出現。
　　 第三部分：Nestin對體外培養(yǎng)的腎小管上

13、皮細胞轉分化后細胞遷移能力的影響
　　 背景：正常情況下，腎小管上皮細胞和間質肌成纖維細胞由腎小管基底膜分隔開來，因此，轉分化的小管上皮細胞只有具備了一定的遷移能力才能突破基底膜進入腎間質。我們前一部分的研究采用Transwell技術證實，體外培養(yǎng)的HKC經TGFβ1誘導轉分化后細胞的遷移能力增加。以往的研究顯示，細胞遷移能力的改變與細胞骨架蛋白結構的重組密切相關。而Nestin是一種結構特殊的第Ⅵ類中間絲蛋白，有可能在各種細胞

14、骨架蛋白中起橋梁作用，參與調節(jié)整個細胞骨架結構的穩(wěn)定。因此，本部分的研究將通過RNA干擾技術，下調Nestin的mRNA和蛋白表達，進而觀察Nestin對于HKC轉分化細胞特異性表型的表達及細胞遷移能力的影響，探討Nestin參與EMT的可能機制。
　　 方法：構建靶向Nestin并帶有U6啟動子和編碼綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的短發(fā)夾狀雙鏈RNA的真核表達質粒(shRNA-Nestin)，轉染體外培養(yǎng)的HKC。觀察TGFβ

15、1誘導轉分化后HKC細胞表型特異性標志物的表達及細胞遷移能力的改變。
　　 結果：轉染shRNA-Nestin干擾質粒后能一定程度抑制轉分化后HKC內Nestin蛋白表達，抑制率為35％左右(與對照質粒相比，P<0.05)。下調Nestin的表達并不改變E-鈣粘蛋白表達減少的趨勢及αSMA表達增加的趨勢(與對照質粒和非轉染組相比，P均>0.05)，但是下調Nestin表達后能導致轉分化后細胞遷移能力明顯下降(128.40±12.

16、4 vs非轉染組193.73±13.51細胞/視野，P<0.05)，抑制率為33.72％。而轉染對照質粒的HKC細胞遷移能力無明顯改變(189.97±11.96 vs非轉染組193.73±13.51細胞/視野，P>0.05)。
　　 結論：Nestin通過影響轉分化后HKC細胞的遷移能力參與了腎小管EMT的動態(tài)進展過程，這將為闡明腎間質纖維化過程中小管EMT的細胞分子機制，進而全方位阻斷慢性腎臟病(CKD)進展提供新的研究和治療