以HIV-1復制和CXCR4、CCR5啟動子為靶點的抗HIV-AIDS藥物篩選系統(tǒng)的建立及應用.pdf

1、背景與目的：獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immure Deficiency Syndrome,AIDS)即艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染,攻擊人類免疫系統(tǒng),破壞大體CD4+T淋巴細胞而引起的一種嚴重免疫缺陷性疾病。艾滋病在全球蔓延的速度令人震驚,我國HIV／AIDS感染者也在迅猛增加。盡管聯(lián)合高效抗逆轉錄病毒療法(hightly active antiret

2、roviral therapy,HAART)在治療艾滋病上已經取得了明顯進展,但是,由于其治療費用昂貴而無法廣泛地應用到發(fā)展中國家,并且毒副作用和多種耐藥株報道已屢見不鮮。為此,開發(fā)和使用低毒、高效、可長期使用的中草藥或者其他廉價藥物治療艾滋病已經刻不容緩。
　　 中藥是我國特有的藥物資源,在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的理論研究與應用方面有著堅實的基礎。中醫(yī)藥治療艾滋病具有藥源豐富、價格低廉、毒副作用小,作用持久等特點,在抗AIDS的研究得到普

3、遍重視。因此,在極其豐富的中藥資源寶庫庫中,如何篩選出抗HIV／AIDS病毒藥物,仍然是急需解決的急迫問題。
　　 分析HIV基因結構:HIV基因組由兩個拷貝的正鏈單股RNA組成,全長約9.7kb,含有gag、pol、env三個結構基因,以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調控基因。在基因組的5’端和3’端各含長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR),其中LTR5’端中含有HIV基因調控所必

4、需的多個特定調控區(qū),是一組真核增強子和啟動子(Promoter)序列。啟動子對HIV病毒的復制起著關鍵作用,如果能夠抑制啟動子的活性就可以阻止HIV病毒復制。
　　 本課題應用了一種以HIV-1復制為靶標,可以在細胞水平應用于常規(guī)實驗室的安全藥物篩選載體(pNL4-3 Luc R-E-)。該載體的特點是:含有HIV-1的核心基因,敲除了HIV-1基因組中env、vpr和nef基因,可在常規(guī)實驗室操作。并且,該載體在nef基因的位

5、置引入報告基因(熒光素酶基因),通過測定報告基因的表達可以反映HIV-1的復制水平,因此,可以此作為評價藥物效果的重要指標。
　　 從HIV病毒攻擊靶細胞的機制分析:CD4分子是HIV進入靶細胞的主要受體,但是僅有CD4尚不足以使HIV病毒侵入細胞,還必須有輔助受體與CD4分子的協(xié)同作用,HIV才能進入宿主細胞。CXCR4(CXC-chemokine receptor4)和CCR5(CC-chemokine receptor5)

6、是HIV感染宿主細胞主要輔助受體,它們主要分布在機體免疫細胞表面,屬于趨化因子家族,是G蛋白偶聯(lián)的膜受體。CXCR4啟動T細胞嗜性(T-tropic)的HIV-1病毒株感染宿主細胞,CCR5則允許M嗜性(M-tropic)的HIV-1病毒株感染宿主細胞。由于在HIV病毒感染的無癥狀期和血清抗體剛剛轉陽所分離出的病毒株主要是M-tropic毒株,利用CCR5在病毒傳播過程中起作用,所以,CCR5主要在病毒感染的早期階段起重要作用。CXCR

7、4則通過T細胞嗜性病毒株在艾滋病感染的晚期起作用。在HIV病毒感染宿主細胞過程中,先是病毒表面的糖蛋白gp120與細胞表面受體蛋白CD4結合,使其吸附在宿主細胞上,gp120再與宿主細胞表面輔助受體CXCR4／CCR5相互作用,使病毒進一步接近宿主細胞,隨后病毒表面的跨膜蛋白gp41發(fā)生構象變化,插入靶細胞膜中,導致病毒包膜與宿主細胞膜的融合,HIV病毒RNA進入細胞。因此,以輔助受體為靶點進行抗HIV研究是近年來研究的熱點。
　

8、　 中藥是我國獨特而豐富的藥物資源寶庫,其中是否存在能夠抑制HIV病毒復制或者影響輔助受體CXCR4和CCR5啟動子的活性、降低其表達的藥物,值得進一步研究。采用中藥血清藥理學方法(Chinese medicine serumpharmacology,CMSP),將單味中藥或復方經口給動物灌服一定時間后,采集動物血液,分離血清,用此含藥血清刺激細胞,不但能夠直接反映中藥和其代謝產物的藥理作用,而且此過程更接近藥物在體內環(huán)境的真實過程,

9、可用于觀察藥物藥效和闡明中藥的作用機制。
　　 本課題將假病毒技術、報告基因技術和中藥血清藥理學技術相結合。運用假病毒技術和報告基因技術,擬建立作用于HIV及其輔助受體CXCR4和CCR5啟動子的安全藥物篩選模型；優(yōu)化實驗檢測條件,建立安全藥物篩選體系；通過檢測報告基因螢光素酶活性,觀察藥物對HIV及其輔助受體的影響；篩選出1-2種具有抗病毒作用的中藥,健康志愿者口服中藥,檢測藥物對人外周血T淋巴細胞表面CXCR4和CCR5的表

10、達的影響；體外病毒實驗,分析所篩選出的中藥,是否對HIV病毒的侵入和復制有抑制作用,驗證藥物的抗病毒效果,建立安全穩(wěn)定的抗HIV／AIDS藥物篩選系統(tǒng)。
　　 方法：
　　 1.設計并合成擴增CXCR4和CCR5啟動子的引物,提取人基因組DNA；
　　 2.以人基因組DNA為模板,PCR擴增CXCR4和CCR5的啟動子基因序列,將其克隆入T載體后,轉化DH5a,進行藍白篩選；
　　 3.PCR鑒定陽性重組

11、子pGEM—T—CXCR4和pGEM—T—CCRS；
　　 4.再將CXCR4和CCR5啟動子分別亞克隆入螢光素酶報告載體pGL4.17中；
　　 5.PCR、雙酶切篩選陽性重組子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5,并進行DNA序列測定；
　　 6.脂質體包裹分別轉染陽性重組子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5以及陽性對照質粒:pGL4.13(含有SV40啟動子)和陰性對照質粒

12、:pGL4.17(不含啟動子)入人淋巴細胞H9細胞(HT—H9)中,G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株；
　　 7.將穩(wěn)定轉染的細胞進行實驗分組。實驗組1:轉染陽性重組子pGL4.17-CXCR4；實驗組2:轉染陽性重組子pGL4.17-CCR5;陽性對照組:轉染pGL4.13質粒；陰性對照組:轉染pGL4.17質粒:
　　 8.熒光檢測儀OloMaxTM96孔板發(fā)光檢測儀檢測穩(wěn)定轉染細胞株螢光素酶活性,驗證陽性重組子中CXCR

13、4和CCR5啟動子活性。
　　 9.采用瞬時轉染法,將含有HIV-1核心基因的載體pNL4-3 Luc R-E-和phRLSV40載體共轉染入人胚腎293T細胞(HEK293T細胞)；
　　 10.優(yōu)化實驗條件:將穩(wěn)定轉染細胞株和瞬時轉染細胞株分別進行實驗優(yōu)化,確定各自的優(yōu)化條件。
　　 結果：
　　 1.PCR擴增獲得CXCR4和CCR5啟動子基因片段,電泳可見,在777bp和987bp處有明亮條帶,這

14、與設計的CXCR4和CCR5啟動子序列長度一致。
　　 2.以T7／SP6為引物,PCR篩選分別得到約為953bp(CXCR4)和1163bp(CCR5)的陽性克隆擴增片段,即為陽性重組子pGEM-T-CXCR4和pGEM—T-CCR5。
　　 3.分別以CXCR4序列引物和CCR5序列引物PCR擴增,電泳可見,在接近750bp處有一明亮條帶,與CXCR4啟動予序列的理論值777bp一致；在接近1000bp處也有一明亮條

15、帶,與CCR5啟動子序列的理論值987bp一致。
　　 4.分別用KpnⅠ／NheⅠ和XhoⅠ／HindⅢ雙酶切鑒定重組載體pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5,電泳可見:在777bp和987bp有明亮條帶與理論值一致。
　　 5.DNA序列測序,陽性重組子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5中CXCR4和CCR5啟動子基因片段與設計的CXCR4和CCR5啟動子序列完全一致。
　　

16、 6.將陽性重組子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5以及陽性對照質粒pGL4.13和陰性對照質粒pGL4.17轉染入HT-H9細胞,測定實驗組1、實驗組2、陽性對照組和陰性對照組的細胞螢光素酶活性,結果顯示:實驗組1細胞螢光值為1127300±96331.5,實驗組2細胞螢光值為1158600±61674.4,陽性對照組細胞螢光值為850045±24520.6,陰性對照組細胞螢光值為349281±19349.4。實驗組

17、1和實驗組2的細胞螢光素酶活性較陰性對照組和陽性組均明顯升高(P<0.01)。
　　 7.實驗優(yōu)化結果顯示:穩(wěn)定轉染組,細胞接種量每孔104個,為最佳實驗條件；瞬時轉染組,細胞接種量為105個每孔,為最佳實驗條件。
　　 方法：
　　 1.選取具有抗病毒作用的16種中藥:丹參、魚腥草、甘草、穿心蓮、夏枯草、黃柏、五倍子、青蒿、大黃、天花粉、紫花地丁、桑白皮、牛蒡子、黃芩、苦參、杜仲(質量符合中國藥典)。采用煎煮的

18、方法將其制成煎劑,分別給成年Wistar大鼠連續(xù)灌胃七天,采血并分離含藥血清；
　　 2.將細胞進行分組:將轉染陽性重組載體pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5的H9細胞分別設19組,同時將轉染含有HIV-1核心基因的載體pNL4-3 Luc R-E-的HEK293T細胞設為19組。16種含藥血清處理的HT—H9細胞和293細胞設為實驗組:正常鼠血清處理的HT-H9細胞和HEK293T細胞設為對照組；只轉染pGL

19、4.17-CXCR4、pGL4.17-CCR5質粒(或pNL4—3 LucR-E-載體),不給與任何干預處理的設為空白組；不含有轉染子的HT-H9細胞和HEK293T細胞為非轉染組。
　　 3.16種含藥血清分別作用于各組轉染細胞,檢測經含藥血清刺激后細胞報告基因螢光素酶活性,判斷藥物對轉染細胞的影響；
　　 4.ELISA檢測經含藥血清刺激后,轉染pNL4-3 Luc R-E-載體的HEK293T細胞P24抗原含量,判

20、斷藥物對HIV-1復制的抑制作用；
　　 結果：
　　 1.含藥血清作用于轉染重組載體pGL4.17-CXCR4的細胞后,細胞螢光素酶活性檢測結果:與對照組(638581.0±16699.5)相比,魚腥草(442365.3±24221.3)、穿心蓮(382135.0±23108.51)、夏枯草(109843.7±5897.2)和黃柏(387082.0±32099.8)能夠顯著降低轉染pGL4.17-CXCR4質粒的細胞螢

21、光素活性(P<0.05)。而甘草(733387.7±41340.7)、五倍子(745135.6±60036.9)、杜仲(747833.1±37638.0)、天花粉(735567.5±38837.2)、紫花地丁(953172.5±46387.2)、桑白皮(704999.1±38774.9)則能顯著升高轉染細胞的螢光素酶活性(P<0.05)。丹參、青蒿、大黃、苦參、牛蒡子、黃芩這六種中藥的含藥血清與對照組相比,其對細胞螢光素酶活性的影響沒有

22、顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.含藥血清作用于轉染重組載體pGL4.17-CCR5的細胞后,細胞螢光素酶活性檢測結果:與對照組(555470.9±42689.8)相比,穿心蓮(356235.3±16377.8)、夏枯草(312649.9±24824.6)、丹參(424948.5±39411.6)和黃芩(346028.9±7363.6)能夠顯著降低轉染pGL4.17-CCR5質粒的細胞螢光素活性(P<0.05),而青蒿(7

23、72168.6±63740.8)、大黃(757875.7±48654.4)、苦參(709069.3±29764.2)、牛蒡子(731764.3±37356.1)、杜仲(671401.6±63175.5)、桑白皮(770887.6±50600.4)則能夠顯著升高轉染細胞螢光素酶活性(P<0.05)。魚腥草、甘草、黃柏、五倍子、天花粉、紫花地丁這六種中藥的含藥血清與對照組相比,其對細胞螢光素酶活性的影響沒有顯著性差異(P>0.05)。

24、>　　 3.轉染pNL4-3 Luc R-E-載體的HEK293T細胞螢光素酶活性結果:與對照組(1.3575±0.10558)相比,魚腥草(0.5165±0.04826)、穿心蓮(0.5231±0.07381)、夏枯草(0.4140±0.07933)、紫花地丁(0.5182±0.06776)含藥血清能夠顯著降低轉染pNL4-3 Luc R-E-載體的HEK293T細胞螢光素酶活性(P<0.05)。而丹參、甘草、青蒿、五倍子、牛蒡子、

25、天花粉、桑白皮、大黃、黃柏、黃芩、杜仲、苦參這12種中藥的含藥血清與對照組相比,其對細胞螢光素酶活性的影響沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 4.ELISA檢測轉染pNL4-3 Luc R-E-載體的HEK293T細胞HIV-1 P24抗原含量,結果顯示:與對照組(2.2673±0.15924)相比,魚腥草(0.734±0.05862)、穿心蓮(1.3056±0.10085)、大黃(1.0963±0.09335)、黃芩(1.

26、1887±0.06088)、黃柏(1.4490±0.114)、紫花地丁(1.3030±0.03318)含藥血清能夠顯著降低細胞裂解液上清中P24蛋白含量(P<0.05),其抑制率依次為,魚腥草:64.66％,穿心蓮:42.42％,大黃:51.65％,黃芩:47.57％,黃柏:30.24％,紫花地丁:42.53％。
　　 5.其中,穿心蓮和夏枯草的含藥血清能夠同時降低轉染pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5、pNL

27、4-3 Lue R-E-載體的細胞螢光素酶活性(P<0.05)。并且,穿心蓮還可以降低轉染pNL4-3 Lue R-E-載體的HEK293T細胞的P24含量。
　　 方法：
　　 1.20名健康志愿者分為兩組,每10人一組,分別口服穿心蓮和夏枯草兩種中藥。每天用量為:穿心蓮9g／d,夏枯草15g／d。每種中藥連續(xù)口服7天,200ml／天,服藥前后,分別采集人外周靜脈血,收集外周血單個核細胞(PeripheralBlood

28、 Mononuclear Cell,PBMC)；
　　 2.免疫磁珠分離并回收CD3+T淋巴細胞,流式細胞術檢測其回收效率；
　　 3.流式細胞術檢測健康志愿者服藥前后外周血T淋巴細胞表面CXCR4和CCR5表達情況；
　　 4.采用實時熒光定量PCR的相對定量法,檢測服藥前后人外周血T淋巴細胞CXCR4和CCR5 mRNA表達水平；
　　 5.Western blot檢測檢測服藥前后人外周血T淋巴細胞C

29、XCR4和CCR5蛋白表達水平；
　　 6.體外病毒抑制實驗,檢測藥物對HIV-1病毒復制的抑制作用。
　　 結果：
　　 1.流式細胞術檢測免疫磁珠分離效果,結果顯示:CD3+T淋巴細胞回收率≧95％:
　　 2.健康志愿者口服穿心蓮,比較服藥前后人外周血T淋巴細胞表面CXCR4和CCR5表達情況:服藥前T淋巴細胞表面CXCR4.表達量為35.61±2.634％,服藥后T淋巴細胞表面CXCR4表達量為1

30、0.28±0.759％,較服藥前降低了約71％；健康志愿者服藥前T淋巴細胞表面CCR5表達量為26.66±2.568％,服藥后CCR5表達量降低到10.57±0.973％,與服藥前相比降低了約60％。
　　 3.健康志愿者口服穿心蓮,比較服藥前后人外周血T淋巴細胞表面CXCR4和CCR5表達情況:服藥前T淋巴細胞表面CXCR4表達量為34.95±2.046％,服藥后降低到9.97±0.864％,較服藥前降低了71％；服藥前T淋巴

31、細胞表面CCR5表達量為25.08±1.928％,服藥后降低到10.26±1.023％,較服藥前降低了約60％。
　　 4.健康志愿者服藥前后外周血T淋巴細胞表面CXCR4 mRNA表達結果顯示:夏枯草組服藥后CXCR4 mRNA表達較服藥前降低了3倍(P<0.05),穿心蓮組服藥后CXCR4 mRNA表達較服藥前降低了4倍(P<0.05)；
　　 5.健康志愿者服藥前后外周血T淋巴細胞表面CCR5 mRNA表達結果顯示

32、:夏枯草組服藥后CCR5 mRNA表達較服藥前降低了3倍(P<0.05),穿心蓮組服藥后CCR5 mRNA表達較服藥前降低了4倍(P<0.05)。
　　 6.Westen blot結果也顯示:在相對分子量40kD位置處可見CXCR4蛋白表達,在相對分子量46kD位置處可見CCR5蛋白表達,且服藥后CXCR4和CCR5蛋白表達量明顯低于服藥前(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.成功建立了以HIV-1復制和C

33、XCR4、CCR5啟動子為靶點的抗HIV／AIDS藥物篩選系統(tǒng)；
　　 2.優(yōu)化實驗檢測條件,確定了藥物篩選時穩(wěn)定轉染細胞株和瞬時轉染細胞株的最佳實驗條件；
　　 3.穿心蓮和夏枯草的含藥血清能夠同時降低轉染pGL4.17-CXCR4、pGL4.17-CCR5以及pNL4-3 Luc R-E-載體的細胞螢光素酶活性；
　　 4.魚腥草、穿心蓮、夏枯草、紫花地丁含藥血清能夠顯著降低轉染含有HIV-1核心基因的載體p