腸出血性大腸埃希菌O157-H7 LAMP檢測方法的建立及嗜酸乳桿菌食品級表達系統(tǒng)的構建.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血性大腸埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一種新型的食源性致病菌，主要經食品傳播，引起食物中毒，臨床主要表現(xiàn)為出血性腸炎( hemorrhagic colitis，HC)，以及血栓性血小板減少性紫癜（thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP）和溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremi

2、c syndrome, HUS)等。
　　 自1982年美國首次暴發(fā)EHEC O157∶H7感染后，世界各地相繼出現(xiàn)散發(fā)和暴發(fā)性流行性病例，致病性和致死性較高。1986年，我國首次從出血性結腸炎患者中分離到EHEC O157∶H7。目前，已有10多個省份從食品、家禽家畜和腹瀉患者糞便中分離到EHEC O157∶H7。EHEC O157∶H7嚴重威脅到社會公共衛(wèi)生和人類健康。因此，快速檢測和有效防治EHEC O157∶H7感染一直

3、是國內外學者關注的一大難題。
　　 傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法成本低，被廣泛接受，但需分離培養(yǎng)、生化和血清學鑒定等，較為費時。PCR技術是近年來快速檢測EHEC O157∶H7的方法，但需要特殊的儀器，檢測成本高，在特異性、簡便性等方面存在不足[5]。因此，建立一種快速、簡便、準確的檢測方法，對EHEC O157∶H7感染的流行病學調查和防治工作十分重要。
　　 環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal a

4、mplification，LAMP）是日本學者Notomi等建立的一種新的核酸等溫擴增技術，其原理是，針對靶基因的6或8個區(qū)域設計4或6種特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件（約65℃）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。LAMP能夠高效、快速、靈敏、特異地擴增靶DNA，操作簡便，成本低，適于大規(guī)模樣品的檢測和基層單位推廣應用，現(xiàn)已廣泛應用于疾病診斷、病原微生物檢測以及動物胚胎的性別鑒

5、定等。
　　 本研究以EHEC O157∶H7的rfbE基因(GenBank:S83460.1)為靶序列，運用在線引物設計軟件Primer Explorer4.0設計LAMP引物，對各擴增條件進行優(yōu)化，建立LAMP反應體系。同時進行PCR檢測，比較這兩種方法的靈敏度、特異性和對實際樣品的檢測結果，以證實LAMP的現(xiàn)實可行性。
　　 針對EHEC O157∶H7感染，目前臨床上主要以預防和支持療法為主，尚缺乏特效的治療藥物

6、。采用抗生素療法，可能導致EHEC O157∶H7的細胞壁溶解，促進致死性志賀毒素(Shiga toxin，Stx)的釋放，加劇患者并發(fā)溶血性尿毒綜合癥的危險性?？梢姡兄瞥霭踩?、有效的疫苗，對預防EHEC O157∶H7感染具有重要意義。
　　 目前，國內外對EHEC O157∶H7的疫苗研究主要集中在多糖結合疫苗、細菌ghost疫苗、基因工程亞單位疫苗、轉基因植物疫苗和Stx類毒素疫苗等，雖然取得一定的進展，有的已進入臨床實

7、驗，但也存在一些缺陷。迄今為止，尚無理想的疫苗推廣應用。
　　 近年來，乳酸菌(Lactic acid bacteria)作為載體表達和傳遞目的抗原的研究備受關注。該菌安全、無毒，被公認為安全級微生物（GRAS，generaly recognizeas safe）。隨著乳酸菌各類表達調控元件的分離，相繼發(fā)展了一系列適用于乳酸菌的克隆載體、表達載體、整合載體，而乳酸菌食品級高效表達系統(tǒng)的構建及應用則是該領域研究的前沿和熱點。因此，

8、本研究擬構建食品級嗜酸乳桿菌表達系統(tǒng)，作為EHEC O157∶H7活載體疫苗的抗原投遞系統(tǒng)，添加至動物飼料中以免疫動物，從源頭上控制EHEC O157∶H7感染，保證食品安全。在EHECO157∶H7感染暴發(fā)流行期間，免疫易感人群，有效控制疾病的蔓延。
　　 乳酸菌食品級表達系統(tǒng)必須具備以下條件:
　　 1、載體必須是食品級的，不得含有非食品級功能性DNA片段，主要是抗生素編碼基因;
　　 2、表達宿主必須是安全

9、的食品級微生物;
　　 3、誘導物必須是食品級的，如乳鏈菌肽、乳糖、嘌呤、嘧啶、蔗糖等可被人食用的物質。
　　 本項研究選用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為外源基因表達的宿主菌，具有以下特點:
　　 1、該菌是人和動物胃腸道內正常菌群（益生菌），安全無毒;
　　 2、可合成和分泌外源目的蛋白;
　　 3、能黏附定植于黏膜上皮細胞，與黏膜免疫系統(tǒng)直接接觸，誘發(fā)有效

10、的黏膜免疫應答，在第一時間抵御病原微生物的感染;
　　 4、無需大量培養(yǎng)細菌或純化目的抗原;
　　 5、研制成酸奶，以口服方式免疫接種。
　　 可見，嗜酸乳桿菌是理想的基因工程活載體疫苗的表達系統(tǒng)。
　　 利用細菌營養(yǎng)缺陷型互補的原理，用嗜酸乳桿菌LacF基因作為選擇標記，構建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳桿菌（LacF-突變株）和半乳糖苷酶互補型載體（LacF+質粒），構成乳糖誘導的食品級嗜酸乳桿菌表達系統(tǒng)，為

11、研制預防EHECO157∶H7感染的食品級活載體疫苗奠定基礎。
　　 二、研究方法
　　 1、根據(jù)EHEC O157∶H7的rfbE基因序列（GenBank: S83460.1）的保守區(qū)，設計出特異的LAMP引物，對各擴增條件進行優(yōu)化，建立25μL的LAMP反應體系。
　　 2、以39株實驗菌株基因組DNA為模板，建立LAMP與PCR法檢測方法，并對比兩者的特異性;將過夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7標準菌株進行

12、稀釋，分別進行LAMP和PCR擴增，比較兩者的靈敏度。
　　 3、在待檢的32份豬肉樣品（EHEC O157∶H7陰性）中，取3份樣品用EHEC O157∶H7進行接種，隨后做LAMP和PCR檢測，并與國標法進行比較。
　　 4、從嗜酸乳桿菌ATCC4356染色體基因組中擴增出LacF基因，并連接到PMD-19 T，擴增出含有LacF兩端同源重組序列的重組子，并連接至PUC-19。將突變體LacF經PCR擴增后，連接至上

13、述載體，進行LacF無義序列的替換(PUC-19∶△LacF)。將△LacF經過T-A克隆后，亞克隆到敲除載體PBR322，鑒定后電轉化至嗜酸乳桿菌，印章法篩選出突變株，并行Southern鑒定。
　　 5、以pNZ9530質粒為模板，擴增RepA-RepC復制子和nisin啟動子Pnis，連接至骨架質粒pIlac，人工合成MCS多克隆位點，并克隆至以上質粒，最后將LacF克隆至該載體，構建成以LacF作為選擇標記的半乳糖苷酶互

14、補型質粒，將質粒轉化至上一步構建的突變株，觀察其在乳糖培養(yǎng)基上的生長情況。
　　 三、結果
　　 1、成功建立優(yōu)化的LAMP反應體系。
　　 2、LAMP法檢出EHEC O157∶H7的特異性較PCR法高，LAMP的檢測限為101cfu/ml，比PCR高出一個數(shù)量級。
　　 3、對于實際樣品，LAMP和PCR與常規(guī)檢測結果一致，均可檢出3份EHECO157∶H7陽性樣品。
　　 4、本實驗獲得La

15、cF缺陷同源性片段△LacF，成功構建重組敲除載體PBR322-△LacF，經篩選與鑒定，獲得半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳桿菌。
　　 5、成功構建以LacF作為選擇標記的半乳糖苷酶互補型質粒，將該載體電轉化至上述突變株，并在乳糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，突變株恢復了生長，表明半乳糖苷酶互補缺陷型嗜酸乳桿菌表達系統(tǒng)構建成功。
　　 四、結論
　　 通過優(yōu)化LAMP反應體系和反應程序，成功建立檢測EHEC O157∶H7的LAMP技

16、術，擴增產物經肉眼即能觀察到白色沉淀，加入SYBR GreenⅠ后在紫外照射下呈強熒光，且擴增產物經凝膠電泳后能觀察到特異性的梯度條帶。LAMP技術的特異性和靈敏度均優(yōu)于PCR法。在實際樣品的檢測中，兩種方法均可檢出EHEC O157∶H7陽性樣品，與國標法一致，表明LAMP可簡便、快速、高度特異地檢出EHEC O157∶H7，適于大規(guī)?，F(xiàn)場樣品的檢測和流行病學調查，適宜于基層單位推廣應用。
　　 利用細菌營養(yǎng)缺陷型互補的原理，