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1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文bufalin在誘導人類白血病HL60細胞凋亡過程中下調Bcl2表達激活PKCβⅡ姓名:田昕申請學位級別:碩士專業(yè):內科學指導教師:劉云鵬2000.4.1材料與方法一藥品與器材蟾蛛靈、TPA、魚精蛋白、RNA酶、PI、胎牛血清、抗體、【,一PZ]ATPCo培養(yǎng)箱、流式細胞儀、高速低溫離心機、紫外分光光度計、電泳儀又光學顯微鏡、GDS8000圖象分析儀、液閃儀等。二.實驗方法1.細胞培養(yǎng)人類髓性白血病HL60細胞生
2、長于含有10%熱滅活胎牛血清12Uml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,在379095%空y5%CO、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),所有實驗均采用處于對數生長期的細胞。2.細胞生存率測定和形態(tài)學檢測用不同濃度的bufalin作用HL60細胞1一72小時,采用臺盼藍拒染法測定細胞生存率,瑞氏一姬姆薩染色,光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。3.流式細胞儀細胞周期解析用不同濃度的bufalin作用HL一60細胞1一24小時后收集細胞,以冷磷酸緩沖液丈
3、PBS),離心洗滌2次,加人體積比為70%的冷乙醇4℃過夜,冷PBS離心洗滌2次,加人RNA酶(200ELgml)37`C孵育1小時,加PI(20“nml)4`C避光染色30分鐘后進行流式細胞儀檢測,分析細胞周期。4.PKC活性測定1)細胞漿與細胞膜蛋白的分離提取取1x10.個細胞分別加人10一,M10一‘fm及100Mbufalin,不加任何處理因素的細胞為空白對照,培養(yǎng)60分鐘,以后的操作均在4℃以下進行。分別提取胞漿和胞膜蛋白,蛋
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