甲硫氨酸硫氧化物還原酶A對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞活性的影響.pdf

1、白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的、以皮損處色素脫失為特點(diǎn)的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。以往的研究發(fā)現(xiàn)其與遺傳、自身免疫等有關(guān)，近年來(lái)氧化應(yīng)激成為白癜風(fēng)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。
　　正常情況下，皮膚ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中，而白癜風(fēng)中這一平衡被打破。已證實(shí)多個(gè)外源性因素及多條內(nèi)源性通路的紊亂導(dǎo)致了ROS的持續(xù)異常產(chǎn)生。在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮可檢測(cè)到濃度范圍為10-3M的H2O2蓄積，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理濃度10-7M-10-6M。
　　

2、ROS的作用靶之一是蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基。其中含活性硫側(cè)鏈的甲硫氨酸對(duì)氧化損傷尤為敏感，被氧化為甲硫氨酸硫氧化物。而甲硫氨酸硫氧化物還原酶（Methioninesulfoxidereductases,MSR）能逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，參與甲硫氨酸的再生。該酶具有立體結(jié)構(gòu)特異性，分為MSRA及MSRB。其中MSRA特異性地還原甲硫氨酸-S-硫氧化物，定位于細(xì)胞漿和線粒體；MSRB特異性地還原甲硫氨酸-R-硫氧化物。MSR是一個(gè)獨(dú)特的抗氧化酶系統(tǒng)，它

3、不僅參與氧化損傷的修復(fù)，同時(shí)也是ROS清道夫，在抗氧化防御、調(diào)控生物體壽命以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能等方面扮演著舉足輕重的角色。
　　MSR是皮膚抗氧化網(wǎng)絡(luò)的重要成員，角質(zhì)形成細(xì)胞及黑素細(xì)胞均表達(dá)MSR，這對(duì)皮膚氧化-還原平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持起著非常重要的作用。然而，新近文獻(xiàn)報(bào)道白癜風(fēng)中該酶系統(tǒng)嚴(yán)重受損：患者整個(gè)表皮，尤其是皮損區(qū)MSR的表達(dá)及活性顯著降低，10-3M的H2O2可使重組MSRA的活性下降85％。計(jì)算機(jī)模擬分析顯示MS

4、RA活性部位的甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸殘基被氧化。
　　MSRA，這個(gè)獨(dú)特的抗氧化酶，兼具修復(fù)蛋白質(zhì)的氧化損傷及降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平的功能，我們推測(cè)MSRA表達(dá)水平的下降不利于氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞的生存，會(huì)導(dǎo)致黑素細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增高，這可能是白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞喪失的機(jī)制之一。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)：MSRA特異的siRNA有效序列的篩選
　　1.主要方法
　　用三對(duì)MSRA特異的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)

5、胞系Hela，每次轉(zhuǎn)染均分為空白對(duì)照組（不含siRNA），陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照Non-targetingsiRNA）及實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染MSRAsiRNA）。于轉(zhuǎn)染后24h及48h分別行RT-PCR及Westernblot檢測(cè)MSRA被抑制的情況。
　　2.主要結(jié)果
　　RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示＃111798MSRAsiRNA對(duì)靶基因的抑制效果最好。與陰性對(duì)照組相比，在內(nèi)參照GAPDH表達(dá)水平一致的前提下，

6、轉(zhuǎn)染了＃111798MSRAsiRNA的Hela細(xì)胞MSRA的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯降低。
　　3.主要結(jié)論
　　RNAi技術(shù)為我們研究MSRA表達(dá)水平下降對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞活性的影響提供了可能。本部分實(shí)驗(yàn)篩選出了最有效的MSRAsiRNA序列，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)：MSRA對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞活性的影響
　　1.主要方法
　?。?11798MSRAsiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)

7、染永生化的人表皮黑素細(xì)胞系PIG1，于轉(zhuǎn)染后48h及72h分別進(jìn)行RT-PCR及Westernblot檢測(cè)黑素細(xì)胞中MSRA被抑制的情況。每次轉(zhuǎn)染均設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。用1mM的H2O2處理轉(zhuǎn)染后的三組黑素細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　2.主要結(jié)果
　　MSRAsiRNA成功抑制了黑素細(xì)胞中MSRA的表達(dá)。MSRA表達(dá)水平的下降使得黑素細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增高，與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即使在無(wú)外

8、源性H2O2時(shí)，MSRA表達(dá)被特異性抑制的黑素細(xì)胞活性較之空白對(duì)照組也顯著降低。
　　3.主要結(jié)論
　　我們的研究證實(shí)MSRA表達(dá)水平的下降導(dǎo)致導(dǎo)致黑素細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增高，這可能是白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞喪失的機(jī)制之一。此外，即使在無(wú)外源性氧化應(yīng)激時(shí)，MSRA的表達(dá)被特異性抑制后也不利于黑素細(xì)胞的生存，提示其在黑素細(xì)胞正常功能中的重要作用。白癜風(fēng)中包括抗氧化系統(tǒng)、黑素合成及代謝系統(tǒng)、6BH4合成/再循環(huán)系統(tǒng)等多個(gè)方面均遭受R

9、OS的不利影響。我們推測(cè)在白癜風(fēng)中存在著一個(gè)惡性循環(huán)：H2O2因氧化酶活性部位的氨基酸殘基而使上述系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶失活，紊亂的各條通路導(dǎo)致清除ROS的能力下降及內(nèi)源性ROS的異常產(chǎn)生。MSRA的表達(dá)水平在白癜風(fēng)患者中顯著降低，且MSRA自身也因H2O2氧化而失活，這意味著一方面關(guān)鍵酶的氧化損傷得不到有效的修復(fù)，另一方面會(huì)使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高及線粒體膜電位下降，從而進(jìn)一步加重了氧化應(yīng)激。內(nèi)源性及外源性H2O2最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞功能喪失，甚至