糖尿病大鼠視網(wǎng)膜基因表達譜差異初步分析.pdf

1、目的： 1．應(yīng)用第二代差異顯示技術(shù)一限制性片段差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Differential Display-Polymerase ChainedReaction，RFDD-PCR)，通過建立大鼠糖尿病模型，在相同的遺傳背景下比較正常視網(wǎng)膜和糖尿病8周視網(wǎng)膜基因表達譜的差異。探討RFDD-PCR用于初步大范圍篩選疾病相關(guān)基因的可行性，并確定下一步研究的候選基因。 2．進一步觀

2、察篩選出的候選基因在糖尿病不同病程中視網(wǎng)膜的表達，初步探討其在糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)發(fā)生中可能的作用機制。 方法： 1．SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶制備糖尿病動物模型。采用RFDD-PCR技術(shù)平行操作，建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜兩種基因表達譜。 2．應(yīng)用高電壓垂直電泳系統(tǒng)，以7％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離表達基因片段，Typhoon9200成像系統(tǒng)和圖像分

3、析軟件ImageQuantTL，ImageTool，F(xiàn)ragment Analysis軟件對凝膠圖象進行分析，確定表達片段與差異表達片段數(shù)目。 3、通過生物信息學(xué)方法對兩個樣本差異表達譜進行分析，初步確定DR相關(guān)基因(或EST)，尋找有價值的候選片段。 4．隨機選組進行重復(fù)操作，檢查方法的重現(xiàn)性。 5．通過半定量RT—PCR對篩選出的候選基因在糖尿病4周、8周、24周的表達進行動態(tài)觀察。 結(jié)果：

4、1．建立了大鼠糖尿病視網(wǎng)膜及正常視網(wǎng)膜基因表達譜：共獲得有意義的表達片段3639條，片段大小集中在50bp～1000bp之間，包括DR：1826條，NR：1813條。有差異的片段840條，占表達數(shù)的23.08％。與正常相比，糖尿病狀態(tài)下表達信號減弱的基因／EST片段283條，增強的225條，消失的145條，出現(xiàn)的187條。 2．7個“表達窗”重復(fù)試驗的差異顯示片段數(shù)目，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差別無顯著性；差異條帶的位置、熒光強度和變化前

5、后基本一致。 3．差異表達譜生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，糖尿病狀態(tài)下： 1)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體 iGluRl表達明顯下調(diào)，iGlLtR2、iGlL,R3、iGlIJR4有不同程度下調(diào)。iGluR6輕度上調(diào)，iGluR5和iGl LIR7表達無變化。NMDA型受體明顯上調(diào)：mGluRl、4、5、7、8，均有不同程度上調(diào)。 2)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體GABA<,A>-R和GABAB-R上調(diào)，兩者相比，前者上調(diào)更為明顯

6、：GlyR表達無變化。 3)光感受器功能相關(guān)基因：GRKl、arrestin、phosdtlcin、rod CNGchannel和Rpe65全部下調(diào)。 4)細胞因子IL-18表達下調(diào)。 5)信號傳遞分子STAT5表達下調(diào)。 4．候選基因半定量RT-PER顯示 1)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體GluRl：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達明顯下調(diào)，8周、24周維持較低水平表達。 2)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)

7、受體GABA<,A>-R：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達明顯增強，8周、24周表達較4周時增強。 3)光感受器功能相關(guān)基因： GRKl：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜的表達開始下調(diào)，8周時表達明顯下調(diào)，24周表達最低； Phosducin：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周時視網(wǎng)膜表達降低，8周時表達明顯下調(diào)，24周表達最低； rod CNG charmel：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達下

8、降，8周明顯下降，24周表達最低； Rpe65：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達下降，8周明顯下降，24周表達最低。 4)細胞因子IL-18：與正常相比，糖尿病4周，視網(wǎng)膜高表達增強；8周表達降低：24周表達最低。 5)信號傳遞分子STAT5：正常及糖尿病4周視網(wǎng)膜未見表達，8周時可見表達，24周表達最強。 結(jié)論： 1．根據(jù)兩種狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜64個“表達窗”所顯示的條帶總數(shù)，8個“表達窗”

9、重復(fù)實驗差異片段的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果，以及通過生物信息學(xué)方法比較所篩選出的候選基因數(shù)目和種類看，RFDD-PCR由于具有高靈敏性、高覆蓋率、和高重現(xiàn)性的特點，可用于大范圍疾病相關(guān)基因的初步篩選。且可不受以往研究結(jié)果的限制，有利于尋找新的疾病研究切入點。 本課題借此方法篩選出了若干以往未見報道的DR相關(guān)基因，為DR發(fā)病機制的研究提供了新的線索。 2．糖尿病早期，視網(wǎng)膜內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體、受體各亞型間表達方式，以及光感