染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4在肝癌細胞增殖和侵襲中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、一、研究背景
　　原發(fā)性肝癌最常見類型為肝細胞肝癌,它在全球最致命癌癥中排名第三,僅次于肺癌和胃癌。全球每年有750,000新發(fā)病例,肝細胞肝癌還是全球第六常見腫瘤,在其檢測和治療方面,目前仍存在著非常大的爭議。小肝癌治療效果非常好,但是由于肝癌的隱匿性較高,臨床癥狀不明顯,臨床診斷的大部分肝癌患者,都已發(fā)展到腫瘤晚期,對晚期肝癌有效的治療手段非常有限。從分子生物學角度來看,肝癌是高度異構(gòu)型腫瘤。越來越多的研究表明,肝癌的復雜性和

2、臨床多樣性,主要是由于基因在疾病發(fā)生和發(fā)展的過程中的變異越來越多。有文獻報道,肝癌的發(fā)生和發(fā)展是由于各種細胞通路的異常激活,比GSK-3β-C/EBPα-miR-122-IGF1R、HDGF-related protein-3、FoxM1/ACP5、JAK/Stat等等。而且,有研究表明JAK/Stat細胞通路在肝癌的發(fā)展過程中起著非常重要的作用,通過抑制JAK/Stat通路,對肝癌的治療起著非常重要的作用。因此,鑒別新的肝癌的分子調(diào)控

3、機制,目前已作為肝癌治療的重要的研究領(lǐng)域和熱點。
　　二、研究目的
　　本研究旨在研究染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome4, SMC4)在肝癌細胞侵襲和增殖中的重要作用及其調(diào)控機制。
　　三、材料和方法
　　1.原發(fā)性肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織各72例,均來自原發(fā)性肝癌患者標本。Real-time PCR、western blotting和IHC檢

4、測SMC4在肝癌組織和細胞中的表達水平。利用統(tǒng)計學方法分析SMC4的表達水平與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
　　2.為了研究SMC4在肝癌中的作用,首先合成3個干擾片段和1個陰性對照,并利用real-time PCR和western blotting技術(shù)篩選出SMC4的最佳干擾片段。構(gòu)建的SMC4干擾載體(homo-830),利用轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到肝癌細胞中進行深入研究。利用細胞劃痕修復實驗和侵襲實驗,研究SMC4在肝癌細胞侵襲中的作用;

5、細胞克隆形成實驗和WST-1實驗,檢測SMC4在肝癌細胞增殖中的作用。
　　3.利用生物信息學軟件對SMC4的3’UTR進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-219與SMC4有兩個結(jié)合位點。利用real-time PCR技術(shù)檢測miR-219在肝癌組織和肝癌細胞中的表達情況。將 miR-219的模擬物和抑制物,分別轉(zhuǎn)染到97-H和 HepG2細胞中,利用real-time PCR和western blotting技術(shù)檢測SMC4在肝癌細胞中表

6、達情況的變化。熒光素酶報告基因技術(shù),分析miR-219與SMC4結(jié)合活性。
　　4.通過PIPs和Donime軟件對SMC4的下游調(diào)控因子進行分析,結(jié)果提示JAK2/Stat3為SMC4潛在的下游調(diào)控位點。利用real-time PCR和western blotting技術(shù)對JAK2/Stat3在肝癌細胞和組織中的表達情況進行分析。通過轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體(homo-830),利用real-time PCR和western blo

7、tting分析SMC4和JAK2/Stat3之間的調(diào)控關(guān)系,免疫共沉淀技術(shù)檢測Stat3的磷酸化位點。最后,通過干擾miR-219的表達變化,利用western blotting技術(shù)研究miR-219與JAK2/Stat3之間的調(diào)控關(guān)系及Stat3的磷酸化情況。
　　四、統(tǒng)計學方法
　　利用 SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析。兩樣本均值組間比較采用t檢驗,SMC4的表達水平與臨床參數(shù)之間的關(guān)系采用 U檢驗,計量資料用均數(shù)±標準

8、差來表示,P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　五、結(jié)果
　　1. Real-time PCR和 western blotting結(jié)果均提示,SMC4在肝癌組織和細胞中的表達明顯上調(diào),相對于正常對照組;免疫組化結(jié)果也提示,SMC4在肝癌組織中的表達明顯上調(diào)。統(tǒng)計學結(jié)果得出,SMC4在肝癌中的表達水平與腫瘤大小、細胞分化、TNM分期和血管侵犯有關(guān),而與患者的年齡、性別和腫瘤類型無關(guān)。預示著 SMC4的表達水平可能與肝癌患者的不良預后

9、有關(guān)。
　　2. Real-time PCR和 western blotting結(jié)果提示,homo-830為SMC4的最佳干擾片段。細胞劃痕修復實驗和細胞侵襲實驗結(jié)果提示,與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體組的肝癌細胞其遷移率明顯降低;細胞克隆形成實驗表明,實驗組中肝癌細胞增殖率明顯降低;WST-1實驗結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染SMC4干擾載體后,肝癌細胞的增殖率由100％下降到73.4%。因此,以上實驗結(jié)果提示:SMC4在促進

10、肝癌細胞的增殖和侵襲過程中起著非常重要的作用。
　　3. miR-219在4組肝癌細胞和肝癌組織標本中的表達明顯下調(diào)。當miR-219模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染到97-H和HepG2細胞中,real-time PCR和western blotting檢測結(jié)果均提示:miR-219沉默后,會導致SMC4的表達明顯上調(diào);而且miR-219表達增強后,也會導致SMC4表達的顯著下調(diào)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果也提示,miR-219和 SMC4

11、之間存在著負向調(diào)控關(guān)系。
　　4. Real-time PCR和western blotting實驗結(jié)果提示,在基因水平和蛋白水平,JAK2/Stat3在肝癌細胞和組織中的表達水平均明顯上調(diào)。SMC4干擾載體(homo-830)轉(zhuǎn)染到97-H和HepG2細胞中,real-time PCR和western blotting實驗結(jié)果均提示,無論在基因水平,還是蛋白水平,JAK2/Stat3的表達都隨著SMC4的降低而降低。免疫共沉淀實

12、驗結(jié)果顯示,p-Stat3的磷酸化位點為第705號酪氨酸,而第727號絲氨酸的表達無顯著變化。Western blotting結(jié)果提示,在97-H和 HepG2細胞中,miR-219與JAK2/Stat3也存在著負向調(diào)控關(guān)系,酪氨酸的表達也隨著發(fā)生變化。
　　六、結(jié)論
　　SMC4在肝癌中表達明顯上調(diào),其表達水平與腫瘤大小、細胞分化、TNM分期和血管侵犯有關(guān);SMC4能夠促進肝癌細胞的增殖和侵襲;本研究第一次完整研究了肝癌中