一種新的蛇毒磷脂酶A2同源物的純化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、蛇廣泛分布于世界各地，種類繁多。自古以來，蛇毒一直是傳統(tǒng)中醫(yī)使用最廣泛的中藥材之一。因此，對蛇毒中的生物活性成份的研究與開發(fā)一直是基礎醫(yī)學和制藥工業(yè)關注的重要研究領域。中國蛇種豐富，在已發(fā)現的200多種蛇種及亞種中，至今只對少數幾種粗毒或部分純化的蛋白組份進行了抗腫瘤作用研究，絕大部分蛇毒抗腫瘤成份還沒有被發(fā)掘出來。 磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)能夠在磷脂甘油部分的磷脂?；?sn-2)位點選擇性斷裂酯鍵

2、，生成的產物為溶血磷脂和脂肪酸[1],這種酶幾乎存在于所有蛇的毒液中。由于蛇的種類和生活環(huán)境的不同，PLA2在結構和功能上也存在著很大的差異[2]。在蛇毒中存在許多PLA2同工酶，它們之間的氨基酸序列的同源性大于90％，結構也較為相似，但卻具有不同的藥理生理功能[3]。 基于上述背景，本研究以我國南方地區(qū)富有的蝮蛇蛇毒為分離樣品源，擬建立一種簡易、快速分離制備蛇毒蛋白的方法；并對從蝮蛇蛇毒中分離得到的蛇毒蛋白組份進行抗腫瘤活性的

3、篩選與評價，旨在發(fā)現新的具有抗腫瘤作用的蛇毒多肽，為蛇毒在抗腫瘤治療中的應用提供新的藥物。 本文的主要結果與結論如下： 一、建立了一種從蛇毒粗毒中一次性快速分離純化蛇毒蛋白組份的高效液相色譜層析方法。 根據目前所見文獻報道，從蛇毒粗毒分離蛋白組份一般都采用二步或三步以上的方法。為了能實現一次性快速從蛇毒粗毒中分離蛋白組份，我們對文獻報道的方法進行了改進，采用了大顆粒(粒徑300(A))的C18反相硅膠作為高效液相

4、色譜柱的填充料，以乙腈/水(0.1％三氟乙酸)作為洗脫體系，在0～120min內作梯度洗脫。采用該方法一次從蝮蛇粗毒中分離出了16個蛋白組份。 二、高效液相色譜分離得到的16個蛋白組份的純度鑒定 利用反相高效液相色譜法分別對從蛇毒粗毒中分離得到的16個蛋白組份進行純度鑒定。C18反相色譜柱，乙腈/水(0.1％三氟乙酸)為流動相，0～40min梯度洗脫。在上述色譜條件下，一次分離得到的16個蛇毒蛋白組份的蛋白質純度均達到了

5、95％以上，說明本文所建立的方法對蛇毒蛋白的分離具有快速、高純度的效果。 三、高效液相色譜分離的16個蛇毒蛋白組份的分子量確定 分別利用電噴霧電離質譜(ESI-MS)和基質輔助激光解吸附-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)對分離得到的16個蛋白組份進行了分子量測定，其中組份1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15和16共12個組份的分子量分別是1234.615、1234.575、7480、7554、1390

6、0、14504、13912、13962、13974、24748、23337和22695Da。 四、高效液相色譜法分離的蛋白組份的蛋白濃度測定 采用Bradford方法分別對16個蛋白組份進行了蛋白濃度的分析，以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白制作標準曲線。16個蛋白組份從No.1～16的蛋白濃度以次為0.631、2.653、5.780、0.983、10.545、4.586、10.680、15.320、14.460、14.

7、840、54.250、106.958、104.360、69.590、64.858和137.608μg/mi。各組份蛋白濃度的差異很大，說明在蝮蛇粗毒中的含量不同。 五、高效液相色譜分離的蛋白組份對人肝癌Hep3B細胞抗腫瘤活性的形態(tài)學影響 以培養(yǎng)人肝癌Hep3B細胞為模型，對分離得到的16個蛋白組份進行了抗腫瘤活性的篩選與評價。在這16個蛋白組份中，組份3、4、5對培養(yǎng)人肝癌Hep3B細胞有明顯的抗腫瘤活性，我們將這三個

8、蛋白組份分別命名為AHP-3(蝮蛇英文AgkistrodonHalysPallas第一個字母的縮寫)、AHP-4、AHP-5。本文研究考查了AHP-5對人肝癌Hep3B細胞抗腫瘤活性的形態(tài)學影響。 在無AHP-5處理的情況下，Hep3B細胞呈單層生長，細胞分布均勻，成梭形，生長良好。用140μg/ml的AHP-5處理Hep3B細胞，24h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現，細胞生長狀態(tài)明顯較對照組差，并且細胞的體積變小、變形，細胞出現皺縮

9、、變圓、脫落等現象；透射電鏡觀察結果顯示：細胞體積縮小，染色質濃縮，細胞核裂解為碎塊。說明AHP-5對Hep3B細胞具有明顯的抑制和凋亡作用，AHP-5對培養(yǎng)人肝癌Hep3B細胞有明顯的抗腫瘤活性。 六、電泳法確定AHP-5的肽鏈結構 我們采用SDS還原電泳法鑒定AHP-5的肽鏈結構。結果表明，AHP-5在還原電泳條件下，呈出現一條區(qū)帶，表明AHP-5為單一肽鏈組成的蛋白質。 七、AHP-5N-端部份氨基酸序列的

10、測定 采用Edman降解法對AHP-5N-端第1至第15位的氨基酸進行了序列測定，結果表明，AHP-5N-端15個氨基酸序列依次為HLLQFRKMIKKMTKK。經GenBank中protein-proteinBLAST的檢索，AHP-5的氨基酸序列與目前已知的蛋白質序列進行比較，未檢索到與AHP-5N-端第1位至第15位氨基酸一致的氨基酸序列，表明AHP-5是一種新的蛇毒多肽。同時AHP-5N-端的15個氨基酸與已知的其它蛇毒

11、磷脂酶A2(PLA2)具有較高的同源性，因此初步推測該組份為PLA2同源物。 八、AHP-5對人肝癌Hep3B細胞抗腫瘤活性機理的初步研究 由于我們從蛇毒中分離提純出的PLA2同源物為一新發(fā)現的蛋白組份，其生理藥理效應未知，因此我們應用SuperArray芯片，對其進行初步的機理探索。 結果顯示，用140μg/mlPLA2同源物作用于Hep3B細胞12h后，在所選擇的112個基因中，有19個基因表達下調，20個基

12、因表達上調。在下調基因中，下調倍數超過10倍的3個基因，ICAM-1，Integrinα1和LFA1b的主要功能都是介導細胞黏附。在上調基因中，上調倍數超過10倍的基因有Bcl-2和Fas，其主要功能是參與細胞調亡和衰老；Integrinαv，其主要功能是參與細胞黏附；Thrombospondin2，其主要功能是參與血管生成；MTS1和PAI-2，其主要功能是參與腫瘤細胞入侵和轉移。PLA2同源物具有極為廣泛的作用靶點。 九、A

13、HP-5對人肝癌Hep3B細胞周期變化和Ca2+濃度的影響 流式細胞儀檢測細胞周期的變化，結果顯示：Hep3B細胞經140μg/ml和208μg/ml的AHP-5處理后，G1期細胞數量逐漸減少，而S期細胞逐漸增多，G2期則沒有明顯的變化。結果說明：AHP-5可以抑制Hep3B細胞的生長，使細胞停滯于S期。此外，經過處理后的細胞，其二倍體峰前均發(fā)現有明顯的亞G1峰(凋亡峰)，提示有凋亡現象的發(fā)生。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，經過AHP-

14、5處理后的細胞，其膜外表面有明顯的磷脂酰絲氨酸表達，Hep3B細胞內鈣離子的濃度明顯升高，說明AHP-5誘導Hep3B細胞凋亡。 根據上述實驗結果，本論文的結論如下： 一、建立了一種從蝮蛇蛇毒粗毒中快速分離蛋白組份的高效液相色譜方法。該方法采用大孔徑反相硅膠C18制備層析柱，以乙腈/水(0.1％三氟乙酸)為流動相，在時間為0～120min進行梯度洗脫，能一次性從蝮蛇粗毒中分離出16個純度達95％以上的蛇毒蛋白組份。

15、 二、在分離得到的16種蛇毒蛋白組份中，有三種組份在體外對人肝癌Hep3B細胞有抗腫瘤活性。形態(tài)學結果表明，140μg/ml的AHP-5處理Hep3B細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)明顯較對照組差，并且細胞的體積變小、變形，細胞出現皺縮、變圓、脫落等現象；透射電鏡觀察結果顯示：細胞體積縮小，染色質濃縮，細胞核裂解為碎塊。說明AHP-5對Hep3B細胞具有明顯的抑制和促凋亡作用，抗腫瘤活性明顯。 三、凝膠電泳、分子量測

16、定和氨基酸序列分析的結果表明，AHP-5的分子量為13900Da，是由一條多肽鏈組成的蛋白質，N-端第1位至第15位的氨基酸序列為HLLQFRKMIKKMTKK。經GenBank中的protein-proteiBLAST檢索及人工檢索，在已知多肽的N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現與AHP-5結構相同的多肽，但與磷脂酶A2(PLA2)具有較高的同源性，因此推測該組份為PLA2同源物。 四、對AHP-5抗腫瘤作用機理的初步